未经治疗、HBeAg阳性慢性HBV感染儿童中HBV整合的基因组和转录组学特征

《eBioMedicine》：Genomic and transcriptomic features of HBV integration in treatment-na?ve, HBeAg-positive children with chronic HBV infection

　　

摘要
背景：乙型肝炎病毒（HBV）整合是治愈HBV的主要障碍；然而，慢性HBV感染儿童中HBV整合的景观以及对转录活跃病毒整合的局部免疫反应仍不清楚。在此，研究人员旨在阐明该人群中的这一景观。
方法：对18名儿童和28名慢性HBV感染成人进行了基于探针捕获策略的基因组分析。对来自本队列的12名儿童和来自公共数据库的3名成人进行了空间转录组学（ST）分析。
发现：所有患者均为乙型肝炎e抗原（HBeAg）阳性且未经治疗。在基因组层面，尽管独特断点数量相当，但儿童的HBV整合肝细胞克隆扩增水平显著低于成人。在调整混杂变量后，年龄被确定为独特整合断点总频率的独立危险因素（b = 3.22，P = 0.005）。在空间层面，ST显示，在儿童中，具有转录活跃病毒整合的斑点呈现稀疏分布，且在所有斑点中占比较低。值得注意的是，在这些斑点处，儿童表现出适应性免疫细胞（如CD8+ T细胞）减少，但固有免疫组分（髓系细胞、库普弗细胞、活化树突状细胞）和APC共刺激增加，而成人则表现出免疫细胞群的均匀减少。
解读：与成人相比，儿童表现出较低的HBV整合肝细胞克隆扩增和对转录活跃病毒整合的不同免疫特征，为其不同的临床病程提供了新的见解。
资金：传染病分子生物学重点实验室（教育部）。

**慢性HBV感染儿童中HBV整合的基因组与转录组学特征：研究解读**

**一、研究背景与问题**
慢性乙型肝炎病毒（HBV）感染仍是全球重大公共卫生挑战，可导致肝硬化和肝细胞癌（HCC）等严重肝脏疾病。HBV整合是HBV进展和实现临床治愈的关键因素，其整合DNA主要来源于病毒颗粒中的双链线性DNA，是乙型肝炎表面抗原（HBsAg）表达的既定来源。既往研究证实，抗病毒治疗可在基因组和转录组水平降低成人慢性HBV感染者的HBV整合负荷。值得注意的是，累积证据表明，慢性HBV感染儿童经抗病毒治疗后HBsAg消失（临床治愈）的概率高于成人。然而，儿童是否 harbouring 较少的HBV整合事件，从而可能促成这一现象，尚不清楚。此外，肝内免疫微环境对于控制慢性HBV感染至关重要，HBV整合已被认为可通过MLL4整合诱导的超甲基化及随后的免疫重塑来调节肝脏微环境。但儿童与成人在有无HBV整合区域间的免疫状态差异尚未被探索，其挑战在于区分有无HBV整合的区域。新近发展的空间转录组学（ST）技术可提供保留空间信息的全基因组转录组数据，有望解决这一问题。同时，成人研究已将HBV DNA整合与HCC发展联系起来，在TERT、CCNE1和MYC等癌基因和促生长基因中报道了反复整合，并观察到克隆扩增和表达增加。而儿童与成人慢性HBV感染者的HBV整合模式是否存在差异仍属未知。

**二、研究开展与结论**
该研究旨在填补关于HBV整合数量、HBV整合肝细胞克隆扩增或免疫微环境关联在儿童与成人慢性HBV感染者间是否存在根本差异的知识空白。研究采用基于探针的捕获策略和ST测序技术，在HBeAg阳性、未经治疗的慢性HBV感染儿童和成人中，从基因组和转录组水平全面表征了HBV整合特征。该多中心研究纳入了58例未经治疗、HBeAg阳性的慢性HBV感染者，最终对18名儿童和28名成人的肝脏样本进行HBV DNA捕获测序，并对另外12名儿童的肝脏样本及3例来自公共数据库的成人ST数据进行空间转录组分析。研究得出以下主要结论：1）在基因组水平，尽管独特断点数量相当，但儿童HBV整合肝细胞的克隆扩增水平显著低于成人；2）慢性HBV感染儿童中，含有转录活跃HBV整合的病灶呈现稀疏分布且丰度较低；3）儿童和成人对转录活跃病毒整合的局部免疫反应存在差异。这些发现为儿童HBV整合提供了全面见解，加深了对儿科人群慢性HBV感染发病机制和进展的理解。该论文发表在《eBioMedicine》。

**三、主要技术方法**
1. **基于探针的捕获HBV DNA测序**：采用iGeneTech Bioscience（中国）设计和合成的高密度平铺策略探针，覆盖整个HBV基因组，共使用10,633个探针，总有效长度638.13 Kbp，预测覆盖率达99.96%，在Illumina NovaSeq 6000平台上进行150 bp双端测序。
2. **HBV整合水平定量**：整合事件定义为跨越HBV-人类连接点的嵌合读段对，保留至少有4个支持读段的断点。通过两个主要指标量化：独特整合断点数和HBV整合肝细胞克隆扩增水平，后者使用断点频率的中位数（median.FQ）和总频率（total.FQ）估计。
3. **空间转录组学（ST）测序**：使用10x Genomics Visium平台对肝活检组织进行ST测序，利用Seurat的SCTransform函数归一化数据，通过Harmony校正儿童和成人样本间的批次效应，采用Louvain算法聚类。
4. **基于特征基因集的细胞类型评分**：应用文献来源的基因集，使用Seurat的AddModuleScore函数评估每个斑点的富集分数，并比较有和无转录活跃病毒整合区域。
5. **转录活跃病毒整合的鉴定**：将HBV参考序列加入参考基因组索引，通过比对到GRCh38/hg38和HBV基因组联合参考，使用ChimericSeq检测嵌合读段，经UMI去重和基于坐标的聚类定义病毒整合。
6. **多重免疫荧光（mIF）**：对OCT包埋的儿童肝脏样本相邻冷冻切片进行mIF染色，使用CD8、CD68、CD163、CD83、HLA-DR和CD11c抗体标记免疫细胞，通过荧光数字玻片扫描仪成像并用HALO软件定量。

**四、研究结果**

**1. HBV探针捕获测序队列的基线特征**
队列包含18名儿童（平均年龄7.94±3.65岁）和28名成人（平均年龄32.32±10.52岁）患者。大多数特征在儿童和成人患者间具有可比性，但年龄、血小板计数、肝脏组织学炎症和纤维化分期存在显著差异。

**2. 慢性HBV感染儿童中HBV整合肝细胞克隆扩增水平较低，癌症相关HBV整合较少**
通过探针捕获策略分析肝活检组织，共鉴定到35,371个整合断点读段，去重后获得1,910个独特断点。儿童和成人间的独特整合断点数相当，但儿童的克隆扩增水平（total.FQ和median.FQ）均显著低于成人。HBV整合断点主要位于病毒基因组的1100-2200 nt区域，完整包含DR2至DR1结构域。整合位点在两组中广泛分布于各染色体，主要发生在基因间区。儿童中共鉴定到272个整合宿主靶基因（IHTGs），成人为550个，两组间大多数IHTGs不同。儿童中癌症相关IHTGs（如FN1、LTBR）的频率显著低于成人（22% vs. 75%）。多因素分析进一步确定年龄是整合断点总频率的独立危险因素（b = 3.22，P = 0.005）。

**3. 慢性HBV感染儿童与成人的空间肝内细胞异质性**
对12名儿童和3名成人的ST数据进行分析，共保留6,186个高质量组织斑点。通过基于特征的策略对每个斑点进行细胞类型富集评分。儿童中肝细胞评分在cluster 0升高、cluster 3降低，单核细胞、髓系细胞和库普弗细胞富集于cluster 7，成纤维细胞、肝内皮细胞和活化树突状细胞（aDCs）在cluster 3评分较高。两组间簇分布存在显著差异（Pearson卡方检验，χ2 = 181.92，P < 0.001），反映基质和免疫细胞浸润程度的异质性。

**4. 慢性HBV感染儿童中转录活跃HBV整合斑点比例低且分布稀疏**
共鉴定到2,426条嵌合读段。儿童中HBV mRNA在绝大多数斑点（97.4%）中检测到，成人为98.1%。在成人中，HBV mRNA水平与几乎所有免疫细胞类型呈强负相关；在儿童中负相关较弱，而某些固有/调节性免疫细胞呈弱正相关。转录活跃病毒整合斑点比例较低，儿童为7.6%（278/3645），成人为4.3%（110/2541），且呈稀疏分布。通过将HBV阳性斑点分类为cccDNA-only、integration-only、dual-positive和unclassified，儿童中cccDNA-derived转录本斑点中位比例为86.85%，其中cccDNA-only占80.44%，integration-only仅占0%；成人中cccDNA-derived转录本斑点比例为38.74%，cccDNA-only占37.23%，integration-only占0.85%。两组间无显著差异。在独特嵌合读段和不同病毒整合数方面，儿童和成人间无显著统计学差异。

**5. 转录活跃病毒整合断点的差异定位**
转录活跃病毒整合在细胞染色体上无优先热点，儿童和成人中分别定位于178和101个不同IHTGs。儿童中最常观察到APOA1和APOA2，其次是GC、FGA和CLU；成人中APOA2最常观察到，其次是GC和FGA。基因本体富集分析显示两组共享代谢相关和免疫通路，但成人组显示出额外通路（如纤溶酶原激活），且免疫和代谢富集减少。儿童中30%（53/178）的IHTGs上调，1%（1/178）下调；成人中38%（38/101）上调，20%（20/101）下调。儿童组HBV整合诱导的异常表达基因比例显著低于成人组（30% vs. 57%）。两组中HBV整合断点在HBV基因组上的分布相当，聚集在DR2和DR1区域及其附近。

**6. 慢性HBV感染儿童与成人中转录活跃病毒整合区域的免疫微环境对比**
在儿童中，转录活跃病毒整合斑点显示T细胞、初始T细胞、CD8+ T细胞、CD4+ T细胞和APC共抑制通路显著降低，而髓系细胞、库普弗细胞、aDCs和APC共刺激通路增加。mIF染色结果证实了这些发现：转录活跃病毒整合斑点含有更多库普弗细胞（CD68+CD163+）和aDCs（CD11c+HLA-DR+CD83+），但CD8+ T细胞更少。在成人中，所有显著差异的免疫细胞群在转录活跃病毒整合斑点中均均匀减少。这表明儿童可能保留更强的固有免疫和抗原呈递能力，而成人更容易出现免疫耗竭。

**五、讨论与结论**
讨论部分指出，该研究在HBeAg阳性、未经治疗的慢性HBV感染儿童中，从基因组和转录组水平全面分析了HBV整合特征。所有儿童均检测到HBV DNA整合，包括一名1岁患儿。HBV DNA整合在宿主基因组中广泛分布并在HBV基因组DR2至DR1区域富集。儿童HBV整合肝细胞克隆扩增水平显著低于成人，可能归因于感染持续时间较短、癌症相关基因整合较少以及独特的局部免疫微环境。研究还发现整合断点总频率与血清HBsAg或HBV DNA水平无关，因为HBeAg阳性患者中超过一半的HBV转录本源于cccDNA。cccDNA是大多数感染区域HBV转录的主要模板。早期抗病毒治疗可能影响儿童慢性HBV感染的临床结局，需要进一步的干预性研究。在儿童肝活检中鉴定到一些HCC相关基因（如APOB、CLU）的HBV整合，但这些整合可能像"种子"一样易致癌，也可能在此阶段对癌变无影响仅作为标志物。局部免疫浸润模式的根本差异提示儿童保留固有免疫激活和抗原呈递能力，反映了更高的免疫可塑性和更低的免疫耐受突破阈值，这可能有助于解释儿童慢性HBV感染更高的功能性治愈率。研究的优势在于全面概述了HBeAg阳性、未经治疗的儿童慢性HBV感染者中HBV整合的基因组和转录组水平特征，并探讨了儿童与成人间HBV整合区域微环境的差异。局限性包括样本量相对较小（儿科肝活检组织极难获得）、未分析HBeAg阴性或接受抗病毒治疗的儿童、基因组和转录组分析并非来源于同一患者以及缺少本中心成人ST样本（使用公共数据库）。未来需要更大样本量的研究进一步验证。总而言之，研究结论为：采用探针捕获策略和ST测序技术，全面表征了HBeAg阳性、未经治疗的慢性HBV感染儿童中HBV整合在基因组和转录组水平的特征。研究结果强调，慢性HBV感染儿童和成人的HBV整合肝细胞克隆扩增水平和转录活跃整合位点的局部免疫微环境存在显著差异，反映了慢性HBV感染在两个年龄组间不同的临床轨迹。