《Food Bioscience》：Bioactive properties of paraprobiotics and modelling their antilisterial activity in a miniature laboratory model of white cheese over refrigerated storage
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摘要翻译：本研究探讨了采用欧姆加热制备的动物双歧杆菌乳亚种Bb-12（BB）副生菌（BBP，即非活菌益生菌）的生物活性潜力（酶抑制活性和抗李斯特菌活性），并对其在冷藏储存期间伊朗白奶酪（IWC）中的抗李斯特菌活性进行了建模。BBP对单核细胞增生李斯特菌的最低抑
摘要翻译：本研究探讨了采用欧姆加热制备的动物双歧杆菌乳亚种Bb-12（BB）副生菌（BBP，即非活菌益生菌）的生物活性潜力（酶抑制活性和抗李斯特菌活性），并对其在冷藏储存期间伊朗白奶酪（IWC）中的抗李斯特菌活性进行了建模。BBP对单核细胞增生李斯特菌的最低抑菌浓度（MIC）为75 mg/mL，与活菌益生菌相同。在所测试条件下，BBP对α-葡萄糖苷酶和血管紧张素转换酶的体外抑制活性均高于BB。在IWC中，浓度为100 mg/mL的BBP和BB使单核细胞增生李斯特菌的数量分别减少了1.52和1.74 Log CFU/g。遗传算法-人工神经网络（GA-ANN）和自适应神经模糊推理系统（ANFIS）准确预测了冷藏储存期间IWC中单核细胞增生李斯特菌的动态变化，决定系数（R2）分别为0.984和0.983。敏感性分析表明，BBP浓度是影响单核细胞增生李斯特菌存活的最有效因素。本研究证实，副生菌是一种适用于奶酪的生物保鲜剂；同时，GA-ANN和ANFIS在所测试条件下准确预测了IWC中单核细胞增生李斯特菌的存活情况。
**副生菌生物活性及其在白奶酪中抗单核细胞增生李斯特菌效果的智能建模研究——论文解读**
**一、研究背景与目的**
伊朗白奶酪（IWC）作为一种传统发酵乳制品，凭借其温和的风味和柔滑的质地广受消费者喜爱。然而，其较高的水分含量和接近中性的pH值（5.4-5.6）为腐败菌和食源性致病菌的生长繁殖提供了理想条件。单核细胞增生李斯特菌是一种革兰氏阳性、耐冷的食源性病原体，能够在冷藏环境下存活甚至增殖，对即食食品和乳制品的安全构成严重威胁。传统化学防腐剂虽有一定效果，但消费者对天然、清洁标签食品的需求日益增长，促使研究者探索新型天然生物保鲜策略。
益生菌作为生物保鲜剂具有抑制病原菌生长的潜力，但在食品加工和储存过程中保持其活力面临挑战，且对免疫功能低下人群存在安全隐患。在此背景下，副生菌——即灭活的微生物细胞或其组分——因具有益生菌的健康益处却无活力相关风险，成为食品保鲜领域的研究热点。然而，副生菌在乳制品体系中的应用仍十分有限，特别是采用新兴技术（如欧姆加热）制备的副生菌在奶酪中的保鲜效果尚未见报道。此外，尽管预测微生物学领域已取得显著进展，但先进人工智能混合模型（GA-ANN和ANFIS）在副生菌强化奶酪中单核细胞增生李斯特菌存活预测方面的比较研究尚属空白。
本研究旨在填补上述研究空白，主要创新点包括：（1）首次将欧姆加热（OH）制备的副生菌作为生物保鲜剂应用于奶酪；（2）比较活菌益生菌与其副生菌形式在奶酪中的抗李斯特菌活性；（3）首次使用并验证GA-ANN和ANFIS模型在冷藏储存条件下对奶酪中单核细胞增生李斯特菌存活的建模精度。该研究发表于《Food Bioscience》。
**二、主要技术方法**
研究人员采用多种关键技术开展研究：利用欧姆加热技术（电场强度8 V/cm，88°C处理3分钟）制备BBP，并通过平板计数法和流式细胞术确认其非可培养状态；采用肉汤稀释法测定最低抑菌浓度（MIC），以评估体外抗菌活性；通过分光光度法测定血管紧张素转换酶（ACE）和α-葡萄糖苷酶的抑制活性；构建IWC微型实验室模型（microcheese），在冷藏储存（5-6°C）条件下进行21天的单核细胞增生李斯特菌接种和计数实验；运用遗传算法-人工神经网络（GA-ANN，采用NeuroSolution软件包）和自适应神经模糊推理系统（ANFIS，采用MATLAB Fuzzy Logic Toolbox）对实验数据进行建模和敏感性分析。其中，动物双歧杆菌乳亚种Bb-12（BB）菌株来源为Chr. Hansen（巴西圣保罗），单核细胞增生李斯特菌为标准菌株ATCC 13311。
**三、主要研究结果**
**3.1 体外抗菌效果**
通过肉汤稀释法测定，BB和BBP对单核细胞增生李斯特菌的MIC值均为75 mg/mL，二者无显著差异。抑菌圈实验结果显示，BB的抑菌圈直径为17.15±1.20 mm，BBP为18.84±0.80 mm，两者之间无统计学显著差异。值得注意的是，在pH中和后，BB和BBP的抗菌活性仍然保留，表明其抗菌作用不仅依赖于酸化，还与其他活性代谢产物有关。先前基于高效液相色谱（HPLC）和核磁共振（NMR）光谱的代谢组学研究已证实，欧姆加热处理显著增强了BBP中有机酸和短链脂肪酸等抗菌代谢产物的浓度。
**3.2 酶抑制活性**
α-葡萄糖苷酶和ACE是心血管疾病发生发展中的关键酶，分别通过升高血糖水平和血压发挥作用。在三个测试浓度下，BBP对ACE和α-葡萄糖苷酶的体外抑制活性均显著高于BB（p<0.05）。这种增强的抑制活性可能与欧姆加热处理引起的细胞膜通透性增加和细胞内化合物外渗有关，从而提高了BBP中微生物代谢产物的浓度。其可能的机制涉及代谢产物与酶活性位点结合或直接附着于底物，从而阻断酶-底物复合物的形成。但需注意，本研究的主要目的是比较BB和BBP的相对体外抑制潜力，而非进行全面的药理学表征，因此不应将其解释为直接的健康促进作用。
**3.3 副生菌在奶酪中的抗李斯特菌活性**
在对照组（不含BB和BBP的奶酪）中，单核细胞增生李斯特菌数量在储存第10天前呈上升趋势，随后至第21天下降至5.66 Log CFU/g。这种先增长后下降的现象可能归因于初始阶段有利的理化条件和充足的营养物质，而后续下降可能与营养耗竭、pH变化、代谢副产物积累或背景微生物群竞争有关。然而，由于储存期间未分析水分活度、pH和背景微生物群，无法确定对照组下降的具体原因。
在添加BB和BBP的奶酪样品中，单核细胞增生李斯特菌数量在整个储存期间呈持续下降趋势。储存结束时，50和100 mg/mL BB使单核细胞增生李斯特菌分别减少1.22和1.74 Log CFU/g，而50和100 mg/mL BBP使其分别减少0.80和1.52 Log CFU/g，对照组仅减少0.32 Log CFU/g。活菌BB表现出更高的抑菌效果，这可能归因于活菌益生菌与单核细胞增生李斯特菌之间对营养物质的竞争。副生菌的抗李斯特菌活性可能归因于有机酸、细菌素、胞外多糖和短链脂肪酸等多种代谢产物的协同作用。值得注意的是，益生菌及其衍生物的抗菌活性高度依赖于菌株类型、目标病原体以及食品基质的复杂性。
**3.4 建模结果**
GA-ANN模型在IWC体系中确定了单隐层含七个神经元的优化网络结构，结合遗传算法的全局优化能力和Levenberg-Marquardt训练算法，实现了对微生物存活行为的精确预测。ANFIS模型则通过减法聚类算法建立初始模糊规则库，采用最小二乘估计和反向传播的混合学习策略进行参数优化。对于含BB的IWC体系，GA-ANN模型的决定系数R2=0.984（回归方程y=0.993x+0.057），ANFIS模型的R2=0.983（回归方程y=0.981x+0.13）；对于含BBP的IWC体系，GA-ANN模型的R2=0.970（回归方程y=0.938x+0.35），ANFIS模型的R2=0.973（回归方程y=0.955x+0.245）。两种模型均表现出优异的预测性能，数据点紧密围绕1:1线分布，表明模型能够准确捕捉微生物动力学中的复杂非线性关系。敏感性分析表明，BB/BBP浓度是对单核细胞增生李斯特菌存活影响最显著的因素。
**四、讨论与结论**
讨论部分指出，益生菌及其衍生物的抗菌活性受多种因素影响，包括菌株类型、目标病原菌和食品环境等。体外简单的实验体系可能与复杂的食品基质存在差异，因此在实际食品体系中进行验证至关重要。研究还使用了选择性培养基Oxford琼脂进行单核细胞增生李斯特菌计数，但受损或应激细胞的计数可能低于实际值，未来研究可考虑加入预富集或涂层恢复步骤。
研究结论部分指出：本研究验证了欧姆加热制备的BBP作为一种新型生物保鲜剂的可行性，其显示出令人鼓舞的生物活性。除了活菌形式外，灭活益生菌也表现出酶抑制活性，且其效果优于活菌BB。虽然BB和BBP均在冷藏储存期间降低了IWC中单核细胞增生李斯特菌的水平，但活菌益生菌的效果更为显著。GA-ANN和ANFIS模型在预测BB和BBP强化IWC中单核细胞增生李斯特菌数量方面表现出高精度和稳健性。实验数据与预测数据之间的强相关性证实了这些混合框架在捕捉复杂非线性关系方面的有效性。敏感性分析确定了BB/BBP浓度是微生物减少的关键驱动因素。这些结果凸显了GA-ANN和ANFIS作为设计和优化具有增强安全性功能奶酪产品的可靠工具的潜力。
本研究也存在一定局限性：单一化合物对整体抗李斯特菌效应的贡献仍需进一步阐明。未来研究应结合热处理评估热稳定性、蛋白酶处理（如蛋白酶K和胰蛋白酶）以确定蛋白类细菌素是否参与活性，以及尺寸排阻过滤以测量活性化合物的分子量。此类机制研究将提供关于副生菌抗菌功能的更全面信息，并有助于合理设计基于副生菌的生物防腐剂。
