《mSystems》：Novel insights into Radix Pseudostellariae saponins assist Mycoplasma gallisepticum attenuated vaccine to enhance the immunoprotection of chicken
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摘要
鸡毒支原体(MG)是引起鸡慢性呼吸道疾病的主要病原体，MG弱毒疫苗(MGAV)常无法诱导有效的黏膜免疫。太子参皂苷(RPS)是传统中草药的重要生物活性成分，已被用于免疫调节，但其潜在机制仍待阐明。本研究将鸡随机分组，分别接受单独鼻内给予MGAV、MGAV
摘要
鸡毒支原体(MG)是引起鸡慢性呼吸道疾病的主要病原体，MG弱毒疫苗(MGAV)常无法诱导有效的黏膜免疫。太子参皂苷(RPS)是传统中草药的重要生物活性成分，已被用于免疫调节，但其潜在机制仍待阐明。本研究将鸡随机分组，分别接受单独鼻内给予MGAV、MGAV联合不同剂量RPS或相应对照处理。采集血清、气管黏膜和呼吸道灌洗样本，用于抗体检测、细胞因子谱分析、组织学评估及宏基因组/代谢组学分析。RPS显著提高了MG特异性抗体水平，增强了免疫调节细胞因子的表达，同时抑制促炎因子的表达。RPS还通过增加杯状细胞数量和黏膜上皮高度促进气管黏膜完整性。通过宏基因组和代谢组学分析发现，RPS可富集呼吸道细菌Lactobacillus sp. UMNPBX13，该菌与代谢物磷脂酰胆碱(PC)呈正相关。鼻内给予乳酸菌可增加气管黏膜中黏蛋白2(MUC2)和PC水平。同样，PC联合MGAV可通过调节细胞因子和增加MG特异性抗体增强黏膜免疫。这些发现表明，RPS通过调节呼吸道微生物群增强MGAV诱导的呼吸道黏膜免疫，为改善家禽呼吸道疾病疫苗提供了一种新的佐剂策略，其具体机制为富集Lactobacillus sp. UMNPBX13并促进PC产生。
论文解读文章
鸡毒支原体(MG)感染是家禽养殖业中广泛流行的慢性呼吸道疾病，给全球养禽业造成重大经济损失。MG作为一种非侵入性细菌，牢固黏附于呼吸道上皮表面，逃避黏液纤毛清除和吞噬摄取等防御机制，导致气管和空气囊出现炎症性病变。目前疫苗接种是预防MG暴发的主要手段，常用商业化活弱毒疫苗包括F株和Ts-11株。然而，这些疫苗株虽然经过致弱，仍保留残余致病力，可能引发接种后反应，包括局部炎症应答。与传统的肌内注射疫苗相比，鼻内疫苗可在呼吸道乃至远端黏膜组织诱导黏膜免疫，而有效的黏膜免疫被认为是控制上呼吸道病原体的关键因素。植物皂苷作为天然化合物，具有免疫调节、抗炎等多种生物活性，已被作为疫苗佐剂用于调节免疫细胞和激活抗原呈递细胞。然而，太子参皂苷(RPS)与MG弱毒疫苗(MGAV)联合应用及其免疫调节机制的研究仍然有限。
研究人员开展本研究旨在阐明RPS增强黏膜屏障完整性的机制，通过分析呼吸道微生物群和代谢组，鉴定RPS增强黏膜屏障所涉及的差异菌群和差异代谢物，从而阐明其对支原体感染的保护作用。研究取得的重要发现包括：RPS显著提高MG特异性抗体水平，增强免疫调节细胞因子表达同时抑制促炎因子表达；RPS促进气管黏膜完整性，提高杯状细胞数量和黏膜上皮高度；RPS可富集呼吸道共生菌Lactobacillus sp. UMNPBX13，该菌与代谢物磷脂酰胆碱(PC)正相关；鼻内给予乳酸菌可增加气管黏膜中黏蛋白2(MUC2)和PC水平；PC联合MGAV可通过调节细胞因子和增加MG特异性抗体增强黏膜免疫。这些发现证明了RPS增强MGAV诱导的呼吸道黏膜免疫的能力，为改善家禽呼吸道疾病疫苗提供了一种通过调节呼吸道微生物群的新型佐剂策略。该论文发表在《mSystems》。
研究人员主要采用了以下关键技术与方法：将90只30日龄河田鸡随机分为5组，分别给予生理盐水、MGAV(3.0×10? CCU/只)、MGAV联合高(100 mg/kg)、中(20 mg/kg)、低(5 mg/kg)剂量RPS，均经鼻内途径给药，初免后28天加强免疫。采用酶联免疫吸附测定(ELISA)检测血清中MG特异性抗体动态变化及多种细胞因子浓度；运用流式细胞术分析脾脏T淋巴细胞亚群比例；通过阿尔辛蓝(AB)和过碘酸-雪夫(PAS)染色进行组织病理学评估，测量气管黏膜上皮高度和杯状细胞面积。对气管黏液样本进行宏基因组测序和液相色谱-串联质谱(LC-MS/MS)代谢组学分析，并采用Spearman相关性分析进行微生物-代谢物整合分析。研究人员还构建了MG mx-FZ2023株攻毒保护模型，通过聚合酶链式反应(PCR)检测病原、肺脏病变评分进行保护效果评估。此外，进行了鼻内给予乳酸菌和PC的干预实验以验证其免疫调节功能。样本来源于福建省龙岩市长汀县河田鸡保种场。
研究结果部分：
RPS增强MG特异性抗体产生。经鼻内联合给予RPS与MGAV可显著提高鸡的MG特异性抗体滴度。中剂量RPS组在初免后第7天即出现抗体滴度显著升高并持续至第14和21天，加强免疫后中剂量组再次显示出显著的抗体增强效应，高剂量组在多数时间点也表现出优于单独MGAV组的抗体水平，而低剂量组在大多数时间点无显著改善。
鼻内联合给予RPS和MGAV对血清细胞因子谱的影响。RPS增强了Th1相关细胞因子水平，中剂量组在第3天IFN-γ显著升高，第7天所有RPS组均显示IFN-γ升高，中剂量组应答最强。IL-4和IL-5 mRNA水平分别在高剂量和中剂量组的第7天显著上调。相反，RPS给药抑制了多种促炎介质，CCL4在所有RPS剂量组第3天和第7天均显著降低，IL-6和IL-1β在各RPS组第3天显著降低，第7天时IL-17A的抑制仅在中剂量组保持显著。这表明RPS，特别是20 mg/kg剂量，可促进Th1/Th2平衡激活并减弱过度炎症应答。
联合鼻内给予RPS和MGAV增加脾脏T淋巴细胞亚群。流式细胞术分析显示，中剂量组的CD3+、CD4+和CD8+ T细胞频率分别为34.46%±4.71%、19.06%±5.33%和25.41%±7.14%，均显著高于对照组和单独MGAV组，表明RPS作为黏膜佐剂有效增强MGAV诱导的T细胞免疫。
RPS对气管黏膜的影响。中剂量组在初免后第14天IFN-γ和IL-4表达显著上调，IL-1β表达显著抑制。气管黏液中总分泌型免疫球蛋白A(sIgA)水平在第7天和第14天均显著升高。PAS染色显示中剂量组PAS阳性面积(反映杯状细胞数量)较对照组和MGAV组显著增加。这表明RPS通过调节细胞因子表达、增强sIgA分泌和促进杯状细胞增生来增强气管黏膜免疫。
对MG攻毒的保护作用。攻毒后14天，对照组的发病率为83.33%，MGAV组为33.33%，M-RPS组为16.67%。平均肺脏病变面积分别为65.4%、5.8%和1.5%，总肺脏病变评分分别为38、5和2。苏木精-伊红(H&E)染色显示M-RPS组的肺脏和气管黏膜损伤较其他攻毒组显著减轻，表明RPS显著增强MGAV的保护效力，有效减少MG诱导的气管黏膜和肺脏病理损伤。
宏基因组学揭示RPS对MGAV免疫鸡呼吸道微生物群的调节。在门水平，RPS处理组中厚壁菌门、拟杆菌门和蓝菌门的相对丰度显著降低。在属水平，Lachnoclostridium、Ruminococcus和Bacteroides三个属显著减少。在种水平，RPS显著富集有益菌种，包括Pseudomonas otitidis、Neisseria canis、Lactobacillus sp. UMNPBX13和Lactobacillus mucosae，同时抑制Prevotella sp. AM34-19LB、Ruminococcus sp. OF05-2BH和Clostridium sp. CAG:306等菌种。定量PCR(qPCR)验证了Lactobacillus sp. UMNPBX13等差异菌种的变化趋势，证实了微生物群落分析的可靠性。
代谢组学揭示联合给予RPS和MGAV调节呼吸道代谢物。共检测到3,258种代谢物，以VIP>1且P<0.05为标准，在MGAV vs 对照、M-RPS vs 对照和M-RPS vs MGAV比较组中分别鉴定出77、109和68种差异丰度代谢物。与MGAV组相比，M-RPS组中PC(14:0/20:2[11Z])、磷脂酸(PA 21:0/PGF2α)、磷脂酰乙醇胺(PE 18:1[11Z]/P-18:1[11Z])和鞘磷脂(SM d16:1/6 keto-PGF1α)等代谢物显著升高。ELISA验证了关键代谢物的变化趋势与代谢组学数据一致。
宏基因组与代谢组整合分析揭示RPS介导的微生物-代谢物互作。相关性网络显示，RPS富集的乳杆菌属物种(L. sp. UMNPBX13和L. mucosae)与多种免疫调节代谢物包括PC(14:0/20:2[11Z])、L-赖氨酸酰胺和SM(d16:1/6 keto-PGF1α)呈正相关，而RPS抑制的菌种(如Prevotella sp. AM34-19LB和Ruminococcus sp. OF05-2BH)与丙戊茶碱呈正相关，与硬脂酸和PA(2:0/PGF1α)等代谢物呈负相关。
鼻内给予乳酸菌对呼吸道黏膜免疫的影响。RT-qPCR显示乳酸菌在呼吸道中的相对丰度在给药后14天内持续增加，ELISA检测到代谢物PC水平同步升高。MUC2(一种关键黏蛋白基因)的表达在LAB组中显著上调。LAB组血清IFN-γ和IL-4显著升高，IL-1β显著降低，表明产生了平衡的Th1/Th2应答并减弱了炎症反应。AB染色显示气管黏膜上皮高度显著增加，PAS染色显示杯状细胞增生。攻毒后H&E染色显示LAB组仅出现轻度炎症浸润，表明乳酸菌预处理显著减轻了MG诱导的气管黏膜损伤。
PC通过调节细胞因子和增强黏膜防御增强MGAV获得性免疫。40 μg/kg PC组全血IFN-γ表达升高，8和200 μg/kg PC组IL-4显著升高，所有PC剂量组IL-1β表达均显著增强。40和200 μg/kg PC组气管黏膜中MUC2 mRNA和蛋白水平均显著升高。PC(40 μg/kg)+MGAV组MG特异性抗体滴度和总sIgA水平均显著高于单独MGAV组，联合处理组增幅最大。
讨论部分总结：MG感染始于上呼吸道定植，鼻内疫苗接种是诱导黏膜免疫的合理策略，但可能引发局部炎症应答。本研究表明RPS作为MGAV鼻内佐剂具有良好的耐受性，在鸡呼吸道中促进更平衡的免疫应答。RPS联合给予可显著降低促炎细胞因子水平，同时增强关键免疫调节细胞因子表达并增加PAS阳性杯状细胞数量。中剂量(20 mg/kg)比高剂量(100 mg/kg)诱导更高的MG特异性抗体滴度，这可能是因为20 mg/kg处于最佳佐剂窗口内，而100 mg/kg可能超过黏膜耐受阈值导致局部刺激或细胞损伤。乳杆菌作为益生菌群，可调节肺Th1/Th2免疫应答并促进IL-4和IFN-γ等细胞因子分泌。PC作为维持黏膜屏障脂质双层完整性的结构底物，可结合MUC2形成疏水屏障，抑制TNF-α、IL-1β和IL-6诱导的炎症应答。
研究结论：RPS是一种有前景的黏膜免疫调节剂，通过优化呼吸道微生物群，特别是增加乳酸菌丰度来促进代谢物PC的产生，进而提高MG特异性抗体水平和sIgA表达，从而增强MGAV诱导的免疫应答。这些发现凸显了RPS增强疫苗免疫原性的潜力，并为其在增强黏膜屏障功能和减轻炎症损伤方面的作用提供了机制性见解。
