在酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）孢子中构建双酶共显性与组装系统及其在L-核糖生产中的应用

《Food Bioscience》：Construction of a Dual-enzyme Co-display and Assembly System in Saccharomyces cerevisiae Spores and Its Applications for L-Ribose Production

　　

摘要

酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）的孢子作为一种新型的表面展示宿主崭露头角，并已被成功应用于有用产品的生物合成。为了在酿酒酵母孢子表面构建双酶共展示和组装系统，最初使用荧光蛋白作为模型蛋白来验证其可行性。凝固芽孢杆菌（Bacillus coagulans）中的L-阿拉伯糖异构酶（BcAI）和热硝化地杆菌（Geobacillus thermadenitrificans）中的甘露糖-6-磷酸异构酶（GtMPI）的体外组装实验结果表明，这种组装复合物能够显著提高稀有糖L-核糖的生物合成效率。随后，BcAI和GtMPI被共展示在孢子表面，并通过SpyTag/SpyCatcher系统进一步组装，以实现L-核糖的生物合成。当使用10 g/L的L-阿拉伯糖作为底物时，L-核糖的最大转化率达到了约16%。尽管如此，这一16%的转化率与之前报道的值相比仍然处于中等水平。尽管存在这一限制，本研究仍为多酶级联反应的孢子表面组装策略建立了可行性基础，为高价值产品的生物合成奠定了技术基础。

引言

在多酶级联系统中，多个连续的酶促反应被整合到一个反应器中以生成目标产品。这种“一锅法”策略允许耦合反应的连续进行，从而带来了显著的优势，包括缩短处理时间、降低生产成本、减少废物产生以及经济和环境方面的协同效益（Climent等人，2014年）。然而，这些系统在复杂反应环境中的实际应用仍面临诸多挑战，如酶稳定性低、底物/产品传质不良以及代谢通量不平衡。为了克服这些限制，广泛采用了酶固定化技术，通过减少聚集、自溶和蛋白水解来提高酶的稳定性，同时增强结构刚性并为酶促反应创造有利的环境（Cui等人，2018年）。此外，为了解决级联反应中酶分散度高和代谢通量不平衡的问题，将多种酶共定位到多酶复合物中已成为一种有前景的方法。这类多酶复合物的组装策略通常分为三类：无支架酶组装（Feng等人，2017年）、生物分子支架介导的组装（Zhang等人，2018年）和分离化组装（Dubey & Tripathi，2021年）。其中，SpyTag（ST）/SpyCatcher（SC）系统因其在不同温度、pH值和缓冲系统等多种条件下都能形成自发的、不可逆的共价键而受到广泛关注（Yin等人，2018年）。作为一种快速、稳健且具有位点特异性的肽-蛋白偶联工具，该系统已在代谢工程、蛋白质工程、纳米生物技术及其他相关领域得到广泛应用（Du等人，2023年；Gao等人，2016年；Grenier等人，2019年；Ma等人，2018年；Si等人，2016年）。

酵母孢子作为休眠的微生物细胞，具有独特而坚固的细胞壁结构，使其能够抵抗恶劣的环境条件（Clancy等人，2002年；Coluccio等人，2004年；Tachikawa等人，2001年）。曼南糖和葡聚糖层存在于营养细胞壁和孢子壁中，而外层的壳聚糖和二酪氨酸层是孢子耐逆性的关键成分（Briza等人，1988年；Briza等人，1996年）。近年来，将酶展示在酿酒酵母孢子表面上的研究兴趣日益增加（Li等人，2022年；Li等人，2022年；Li等人，2020年；Liu等人，2019年；Si等人，2025年）。值得注意的是，osw2Δ突变孢子因其多孔且松散堆积的二酪氨酸层而成为表面展示的主要载体。这种方法具有优异的可重复使用性和强大的耐逆性（Shi等人，2014年）。例如，展示D-木糖异构酶的osw2Δ孢子和展示D-阿洛糖3-异构酶的dit1Δ孢子已被用于将D-葡萄糖转化为D-阿洛糖（Li等人，2015年）。此外，半乳糖转移酶（HsGalT）和唾液酸转移酶（Pm2,3STM144D，Pd2,6ST）也已在osw2Δ孢子表面成功展示（Chao等人，2022年），这是首次报道在osw2Δ孢子上实现双酶共展示。另外，通过共展示成功构建了两种孢子胶囊系统（CS1：HsGalT和Pm2,3STM144D；CS2：HsGalT和Pd2,6ST），实现了人类寡糖的高效生物合成，突显了孢子表面双酶共展示在多酶级联反应中的可行性和潜力。

L-核糖是D-核糖的对映体，是一种稀有的醛戊糖，因其在多种生物应用中的潜力而受到越来越多的关注（Masao等人，2002年）。除了其已知的与药物相关的生物活性外，包括抗病毒作用（Chen等人，2020年）和诱导肿瘤细胞死亡（Okano，2009年），L-核糖还因其作为低热量功能性甜味剂的潜力而备受关注。作为一种低热量的功能性甜味剂，L-核糖具有较高的甜度，同时在人体内几乎不参与能量代谢，使其成为开发低能量食品的理想候选物质。此外，L-核糖可以通过甘露糖-6-磷酸异构酶（MPI）或L-核糖异构酶（RI）的催化直接从L-核酮糖合成（Zheng Xu等人，2016年）。然而，由于L-核酮糖是一种稀有糖，价格昂贵且难以大量获取，这大大限制了通过这种方式大规模生产L-核糖。相比之下，L-阿拉伯糖是一种低成本且易于获得的底物，利用L-阿拉伯糖异构酶（AI）和MPI进行两步生物合成更为经济高效。据报道，使用来自热硝化地杆菌的纯化GtAI和GtMPI可以制备L-核糖，总转化率为23.6%（Lim等人，2012年；Yeom等人，2008年；Yeom等人，2009年）。此外，还实现了在大肠杆菌中同时表达AI和MPI，从而将L-阿拉伯糖转化为L-核糖，转化率为33%（Kim，Seo，& Oh，2013年）。尽管取得了这些进展，仍需进一步优化酶固定化和共定位策略，以提高该生物合成途径的转化效率和工业应用性。

在本研究中，我们构建了一种利用荧光蛋白融合的ST/SC作为指示剂来监测组装效率的孢子表面双酶共展示和组装系统。具体来说，两种含有ST/SC的酶融合蛋白在体外被组装，目标酶分别为来自凝固芽孢杆菌的L-阿拉伯糖异构酶（BcAI）（Zhou & Wu，2012）和GtMPI（Lim等人，2012）。首先验证了该体外组装系统合成L-核糖的能力，并确定了最佳组装条件。随后，BcAI被单独展示在osw2Δ孢子表面，并对其酶活性进行了系统表征。最终，成功构建了BcAI和GtMPI的双酶共展示和组装系统，并评估了其在L-核糖生物合成中的应用（图1）。结果表明，展示并组装在孢子表面的BcAI-GtMPI复合物能够有效提高L-阿拉伯糖向L-核糖的转化率。除了传统的酶共展示方法外，本研究还提出了一种新的多酶系统孢子表面组装策略，为以L-核糖为代表的高价值产品的生物合成奠定了技术基础。

章节片段

化学品、质粒和菌株

L-核糖和L-核酮糖购自中国上海的Aladdin公司。卡那霉素和异丙基-β-D-1-硫代半乳吡喃糖苷（IPTG）购自中国上海的Sangon Biotech公司。一抗和二抗购自中国北京的TransGene Biotech公司。DNA聚合酶和限制性内切酶由中国大连的TaKaRa公司提供。Ni-NTA亲和色谱柱来自瑞典乌普萨拉的GE Healthcare Bio-Science公司。所有其他使用的化学品

体外自组装多酶复合物的构建

ST/SC这对肽标签是一种广泛用于多酶组装的多功能蛋白质连接工具，能够自发形成稳定的共价异肽键。为了实现多酶复合物的组装，这两种肽片段分别通过柔性（GGGGS）₂连接器与BcAI或GtMPI的N端或C端融合，形成了八种不同的融合构建体（图1A，C）。鉴于融合标签可能会影响酶活性，因此需

结论

总之，本研究在酿酒酵母 osw2Δ孢子表面成功建立了一个双酶共展示和组装系统。作为概念验证示例，BcAI、GtMPI及其相应的融合蛋白（ST-BcAI和GtMPI-SC）在osw2Δ孢子表面得到了高效且稳定的共显示。重要的是，ST-BcAI和GtMPI-SC通过ST之间的特异性共价相互作用在孢子表面自发组装成了稳定的复合物

CRediT作者贡献声明

Zijie Li：撰写 – 审稿与编辑、监督、项目管理、资金获取、概念构思。Yasen Wang：方法验证。Buqing Wang：方法学、实验研究。Xiangkun Du：撰写 – 初始草稿、实验研究、数据分析、概念构思。Yu Shen：数据分析。Shu Teng：实验研究。Jiawen Bai：方法学

Li等人，2022年；Mahmood等人，2025年；Zhang等人，2014年；Xu等人，2016年。

作者声明没有利益冲突。

数据可根据请求提供。

利益冲突声明

我们声明这篇题为“在酿酒酵母孢子中构建双酶共展示和组装系统及其在L-核糖生产中的应用”的手稿是原创的，之前未曾发表，也并未在其他地方考虑发表。

我们确认所有署名作者都已阅读并批准了该手稿。所有作者与投稿无关的利益冲突。

本工作得到了中国国家重点研发计划（2025YFF1107300）和中国国家自然科学基金（32171475）的支持。

Xiangkun Du|Yasen Wang|Buqing Wang|Yu Shen|Shu Teng|Jiawen Bai|Zijie Li

中国江南大学生物技术学院碳水化合物化学与生物技术国家重点实验室，江苏吴兴，214122