基于LC-MS/MS的肽段鉴定、分子模拟与生物学验证用于大黄鱼抗氧化肽的靶向发现

《Food Chemistry: X》：LC-MS/MS-based peptide identification, molecular simulations, and biological validation for targeted discovery of antioxidant peptides from large yellow croaker

　　

食品源抗氧化肽是合成抗氧化剂的理想替代品，但其靶向发现仍具挑战。研究人员集成活性导向分级分离、基于液相色谱串联质谱（LC-MS/MS）的肽段鉴定、分子模拟与生物学验证，从大黄鱼（Larimichthys crocea）蛋白水解物中识别抗氧化肽。LPH-3及其F3亚组分表现出最高抗氧化活性，在F3中鉴定出89条肽段。经计算机（in silico）筛选后，将16个候选肽与Kelch样ECH关联蛋白1（Keap1）进行分子对接，从中选定SG-8、DN-11和GR-13进行合成。SG-8在H2O2损伤的Caco-2细胞中展现出最强自由基清除与细胞保护活性。每个复合物各3次独立的500 ns分子动力学（MD）模拟表明，所建Keap1-SG-8复合物构象偏差更小且估算相互作用能更有利，与实验活性排序一致。逆转录定量聚合酶链反应（RT-qPCR）与ML385抑制实验支持Nrf2相关抗氧化信号参与，但细胞质可用性及直接Keap1-SG-8结合仍未验证。综上，SG-8是一种有前景的海洋源抗氧化肽，值得进一步开发与机制验证。

研究背景方面，氧化应激源于活性氧（ROS）生成与内源性抗氧化防御系统失衡，过量ROS可引发脂质过氧化、蛋白质氧化及DNA损伤，肠道上皮屏障因持续暴露于膳食与环境刺激尤为脆弱。尽管合成抗氧化剂能清除自由基，但其潜在不良反应推动了对食品与健康领域天然替代物的探索，海洋资源因富含优质蛋白成为抗氧化肽重要来源。大黄鱼（Larimichthys crocea）作为中国重要经济海鱼具备开发价值，但传统生物活性肽发现依赖酶解、多步纯化与序贯活性验证，耗时费力，且单独活性导向策略难以提供肽结构与分子靶标互作信息，阻碍候选优先级划分与机制阐释。近年来计算机辅助策略如生物信息学预测、分子对接与分子动力学（MD）模拟提升了筛选效率，但LC-MS/MS产生的庞大候选列表仍使兼顾抗氧化潜力与靶标互作的优先级划分复杂化；Keap1-Nrf2-抗氧化反应元件（ARE）通路是细胞抗氧化防御核心，调控该互作可促进Nrf2介导响应，然而诸多研究仅依赖静态对接，缺乏水相下局部构象行为与互作持久性评价。为此，研究人员在《Food Chemistry: X》发表研究，集成活性导向分级、LC-MS/MS鉴定、计算筛选、模拟与生物验证，旨在从大黄鱼蛋白酶解物中靶向发现抗氧化肽并探索分子基础。

主要关键技术方法上，样本来源于市售福建宁德产大黄鱼肌肉组织，经木瓜蛋白酶水解制备大黄鱼蛋白水解物（LPH）；依次通过10 kDa与3 kDa超滤得LPH-3（<3 kDa），再经Sephadex G-25凝胶过滤层析获F3亚组分；F3与LPH-3均行纳米LC-MS/MS（Orbitrap）肽段鉴定并以PEAKS Studio与Proteome Discoverer分析；候选肽经ToxinPred 3.0、AlgPred 2.0、AnOxPePred与ExPASy ProtParam体内筛选，16条候选用PEP-FOLD3构象建模后以Schr?dinger Glide对Keap1 Kelch域（PDB 2FLU）标准精度对接并Prime MM/GBSA估算；选中SG-8、DN-11、GR-13固相合成；细胞实验采用Caco-2细胞系（H₂O₂损伤模型）行CCK-8、乳酸脱氢酶（LDH）、超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化氢酶（CAT）、谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）、丙二醛（MDA）检测；MD模拟用GROMACS配CHARMM36m力场，每复合物3×500 ns；跨膜实验用Caco-2单层的Transwell模型与反相高效液相色谱（RP-HPLC）及LC-MS/MS；信号通路用RT-qPCR与ML385抑制。

研究结果部分，3.1节活性导向富集与分级显示LPH-3及F3的DPPH与ABTS自由基清除率显著高于其他级分，因此选F3作LC-MS/MS鉴定。3.2节LC-MS/MS肽段鉴定在F3中确证89条唯一肽序，LPH-3补充列表作对照。3.3节计算机筛选从89条中依无毒、亲水、非致敏与高抗氧化预测值缩至16条候选。3.4节分子对接中SG-8、DN-11、GR-13获最优GlideScore与MM/GBSA能，进入合成。3.5节体外自由基清除与Caco-2保护实验中SG-8在25–400 μg/mL剂量下对H₂O₂诱导损伤的细胞活力恢复最强，并显著降低LDH释放、提升SOD/CAT/GSH-Px、压低MDA。3.6节MD模拟显示Keap1-SG-8复合物500 ns内Cα根均方偏差（RMSD）与回转半径（Rg）波动最小，氢键占用稳定，MM/PBSA估算相互作用能最负。3.7节Caco-2单层转运中SG-8（4 mg/mL）120 min基底侧经RP-HPLC与LC-MS/MS检出完整肽，提示其跨肠上皮能力。3.8节RT-qPCR表明SG-8预处理上调Nrf2、NQO1、HO-1并下调Keap1，ML385可逆转该保护，佐证Nrf2相关抗氧化信号参与，但胞质内直接Keap1-SG-8结合未获实验确证。

讨论与结论翻译部分，研究人员指出该集成工作流为海洋源抗氧化肽发现提供实用框架：活性导向分级联合LC-MS/MS大幅缩小候选规模，in silico多层过滤在合成前排除毒性和致敏风险，对接与重复长时MD模拟弥补静态对接不足，使SG-8的优选不仅靠实验活性也靠动态构象稳定性与有利相互作用能支撑；Caco-2模型同时给出细胞保护与跨膜转运证据，RT-qPCR与ML385指向Keap1-Nrf2-ARE轴但尚缺直接结合与胞内定位数据。结论为：SG-8（SYDEYNKG）是源自大黄鱼蛋白酶解物的新型海洋抗氧化肽，兼具自由基清除、Caco-2细胞保护、跨肠上皮转运潜力及Nrf2信号调控迹象，其三重复现500 ns MD模拟显示的较小构象偏差与更有利估算相互作用能同实验活性排序一致；该肽值得后续以同位素标记、表面等离子共振（SPR）或等温滴定量热（ITC）确证直接Keap1结合，并在动物模型中评估口服抗氧化效用。