TIMS-MS与理论建模相结合，利用环糊精-金属离子三元复合物实现黄酮类异构体的分离

《Food Chemistry》：TIMS-MS combined with theoretical modeling for flavonoid isomer separation using cyclodextrin-metal ion ternary complexes

　　

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  开发了一种TIMS-MS方法，用于分析食品样品中的四种黄酮类异构体。
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  β-CD和γ-CD与这些异构体形成了有效的复合物，而α-CD则没有。
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  金属离子将分离分辨率（R_P-P）从0.705提高到了1.679–2.574。
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  理论建模和NCI可视化揭示了关键的结合位点以及TIMS的分离原理。
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  该方法在食品样品中的检测限（LOD）为1.31 ng/mL^?1，回收率≥83.51%。

引言

黄酮类异构体Genistin（Gen）、Apigenin-7-glucoside（Api）、Vitexin（Vit）和Sophoricoside（Sop）（图S1）具有相似的结构，但在糖基化位点和糖苷键连接方式上存在差异。这四种异构体都含有β-D-葡萄糖基团，并且具有类似的三环骨架（A、B、C环）（Xiao, 2017）。尽管这些结构差异很小，但它们在生物活性、体内代谢途径和稳定性方面存在显著差异（El-Feky & Mohammed, 2024）。它们广泛存在于各种药用和可食用植物中，具有抗炎、抗氧化、调节血脂和保护心血管等重要的药理作用，在功能性食品和天然药物开发中也具有很高的应用价值（Zhuang et al., 2024）。因此，准确分离和分析这些异构体成分对于阐明其结构-活性关系至关重要，也是确保临床应用中质量控制和安全性的核心前提。

由于这四种异构体（Gen、Api、Vit和Sop）的分子结构和极性高度相似，传统的分析技术难以实现有效分离和准确鉴定。这一挑战已成为限制这些化合物深入研究和工业应用的关键瓶颈。目前用于这类黄酮类化合物的分析方法主要包括气相色谱（GC）（Cetinkaya et al., 2025）、超临界流体色谱（SFC）（Lesellier & West, 2022）、毛细管电泳（CE）（Singh et al., 2017）、高效液相色谱（HPLC）（Yu et al., 2022）和核磁共振（NMR）（Griffiths, 2008）。其中，GC需要在分析前进行复杂的化学衍生化处理以降低黄酮类化合物的极性并提高其挥发性；而HPLC则依赖于昂贵的色谱柱，并且市场上可用的固定相种类有限（Philbin & Schwartz, 2007）。此外，这两种技术通常需要较长的分离时间，无法满足高通量或快速分析的需求。NMR技术的灵敏度较低，且对样品纯度和数量有严格要求，不适合检测复杂基质中的低丰度目标。质谱（MS）凭借其高特异性、高灵敏度和低样品消耗量的优势，在黄酮类化合物的分析中得到了广泛应用（Griffiths, 2008; Marshall & Hendrickson, 2008）。然而，对于像genistin这样具有相同质荷比的四种异构体，即使是串联质谱（MS/MS）技术也无法实现精确分离和鉴定（Glish & Burinsky, 2008）。

对于传统MS/MS无法区分的异构体（如Gen、Api等），离子迁移谱-质谱（IMS-MS）技术通过精确测量它们的碰撞截面（CCS）值来实现有效区分（Borsdorf et al., 2011）。这个关键参数CCS值源于该技术的独特原理：它不仅依赖于质荷比（m/z），更重要的是，它利用了不同离子在电场下通过缓冲气体的迁移率差异（形状、大小和电荷分布的差异）。由此得到的CCS值可以准确反映气相中离子的三维构型和体积，为结构相似的异构体提供了除传统MS之外的一个独立的分离维度（Dodds et al., 2017）。通过比较上述方法（LC-MS/MS、HPLC、CE、SFC、NCR）（表S1），可以看出TIMS-MS在检测时间、灵敏度和前处理步骤方面具有一定的优势。因此，这项技术有望从根本上解决由m/z引起的精确鉴定难题，为黄酮类化合物的深入研究和质量控制提供关键技术支持。

然而，Gen、Api、Vit和Sop之间的结构差异极为微小。即使使用IMS-MS，由于它们的CCS值差异太小，有效分离仍然具有挑战性。环糊精（CD）作为一类具有特定腔体结构的选择性试剂，可以通过非共价相互作用（如疏水效应和氢键）与目标分子形成稳定的主客体复合物（Cid-Samamed et al., 2022; Crini, 2014; Del Valle, 2004）。进一步引入金属离子作为配体构建三元复合物系统可以显著改善这四种异构体之间的迁移率差异，从而提供一种实现高效分离的可行方法（Wu et al., 2022; Wu et al., 2023）。迄今为止，尚未有针对这四种异构体的高效分离方法被报道，这限制了对这些成分独特药理活性的深入探索和系统阐明，也成为了阻碍相关药用和可食用植物资源高价值加工和工业应用的关键瓶颈。

本研究以Gen、Api、Vit和Sop这四种异构体为研究对象，旨在建立基于陷阱离子迁移谱-质谱仪（TIMS-MS）结合CD介导的主客体识别分析方法。系统评估了α、β和γ-CD对这四种异构体的分离效率，并研究了金属离子的协同增强效应，以筛选最佳的主客体识别系统。此外，还利用密度泛函理论（DFT）计算和可视化分析深入阐明了分子层面的相互作用位点和分离机制。与色谱方法相比，所提出的TIMS-MS/CD–金属离子策略具有简单性、高灵敏度、快速分析、低样品消耗量等优点，并且理论计算提供了精确的支持。最后，基于最佳系统建立了一种可靠的定量分析方法，并应用于实际植物样品中目标成分的检测，从而验证了该方法的可行性和实用性。

章节摘要

试剂

Gen、Api、Vit和Sop（纯度≥98%，分子量：432.38）购自上海Aladdin生化科技有限公司。Puerarin（Pue，纯度≥98%，分子量：416.37）也购自上海Aladdin生化科技有限公司。α-CD、β-CD和γ-CD（纯度均为98%，分子量分别为972.38、1134.98和1296.51）购自上海Aladdin生化科技有限公司。无机金属盐购自新华制药化工试剂有限公司。

四种异构体的直接TIMS-MS分离

由于黄酮类糖苷具有多个羟基，它们可以在负离子模式下脱质子形成[M ? H]^?离子，在正离子模式下质子形成[M + H]⁺离子。如图1a所示，在正离子模式下，这四种化合物在m/z 433.11处显示出特征性峰。然而，TIMS分析结果显示，它们的离子迁移率峰严重重叠，这是由于它们的迁移率值差异非常小。

结论

本研究成功采用了TIMS-MS结合理论计算的方法来分离和分析四种黄酮类异构体（Gen、Api、Vit和Sop）。MS/MS结果显示，Gen/Api与Vit/Sop的碎片离子模式有所不同。与CD的相互作用研究表明，目标异构体仅能与β-CD和γ-CD相互作用，而不能与α-CD相互作用，这归因于β-CD和γ-CD较大的疏水腔体结构，使其能够稳定地与目标分子结合。

CRediT作者贡献声明

Jia Wang： 初稿撰写、软件开发、方法学设计、数据管理、概念构思。 Jiabin Wang： 软件开发、正式数据分析。 Chaoxian Chi： 可视化处理、软件开发、数据管理。 Fangling Wu： 初稿撰写与编辑、可视化处理、监督工作、软件开发、方法学设计、资金筹措、正式数据分析、数据管理。 Chuan-Fan Ding： 项目监督、资金筹措、概念构思。

利益冲突声明

作者声明他们没有已知的可能影响本文工作的竞争性财务利益或个人关系。

致谢

本研究得到了宁波大学高级研究能力建设计划（项目编号GJPY2026024）、国家自然科学基金国际合作与交流项目（W2512055）以及国家自然科学基金（22473065）的支持。

_Jia Wang|Jiabin Wang|Chaoxian Chi|Fangling Wu|Chuan-Fan Ding|