用于增强亲缘关系鉴定和混合样本解析的新型五核苷酸 STR 系统开发验证

《Forensic Science International: Genetics》：Developmental validation of a novel pentameric STR panel for enhanced kinship and mixture resolution

　　

摘要

远程亲缘关系鉴定仍然是法医遗传学中的一个主要挑战，因为常规 STR 试剂盒提供的分辨能力往往不足以解决复杂的亲缘关系场景。为了克服这一局限性，我们开发了一种新型的五聚体 STR 面板，由五个新实施的具有高多态性的位点与 Penta E 组成，旨在补充常规标记在亲缘鉴定和刑事案件鉴定中的应用。

对来自伊比利亚半岛的 304 份 DNA 样本进行了基因分型以表征该面板。五个新标记显示出高水平的多态性，每个位点检测到 18 到 30 个等位基因，并表现出与高信息量 STR（如 SE33 和 D12S391）相当的分辨能力。

通过涉及不同遗传亲缘度数的模拟和真实案例，评估了该面板在亲缘分析中的性能。当与现有的 STR 试剂盒结合使用时，新型多重检测系统提高了涉及二级以内亲属的亲缘案件的分辨率。还评估了其在刑事案件鉴定中的适用性。与传统的四聚体 STR 系统相比，五聚体位点显示出较低的结巴峰（stutter）比率，这可能有助于混合样本的解释。此外，建立了一种等位基因特异性结巴峰阈值，以改善混合 DNA 图谱中结巴峰与真实次要贡献者等位基因之间的区分。新位点的高杂合度也有助于更准确地推断 DNA 混合物中贡献者的数量。最后，开发和法医验证研究，以及针对降解和低模板 DNA 样本分型的优化方案，证实了该面板适用于常规法医应用。

引言

尽管商业 STR 试剂盒广泛可用且往往能解决标准法医案件，但分辨能力不足仍然是法医遗传学中的一个反复出现的限制，特别是在复杂的亲缘关系分析和具有挑战性的混合 DNA 样本中。在法医常规工作中，涉及二级和三级关系（如姑/叔/姨/舅 - 侄女/侄子或表/堂兄弟姐妹）的亲缘调查，使用主要基于四聚体短串联重复（STR）的标准标记集仍然难以解决 [1]。基于大规模平行测序（MPS）的方法，其多重检测能力优于主要基于聚合酶链式反应后接毛细管电泳（PCR-CE）的传统方法，可能有助于解决这些局限性 [2]。然而，常规案件可扩展性有限，加上对专用设备的要求和序列解释的复杂性，仍然限制了许多法医实验室中 MPS 的实施。在这种情况下，当直系家庭成员无法用于基因检测时，扩展标记集的分型是解决远程亲缘关系分析的唯一可能性。在现有标记集的基础上增加具有高法医信息量的补充 STR 位点，是提高复杂亲缘关系统计分析的实用策略。

然而，随着分析标记数量的增加，某些位点位于同一染色体上彼此靠近的概率也随之增加，因此显示出遗传连锁。当附近标记的共遗传频率高于独立分离下的预期时，就会发生遗传连锁。由于连锁影响等位基因的传递概率，它可以影响亲缘分析中的似然比（LR）计算，根据具体情况增加或降低证据价值 [3]。因此，使用扩展标记集需要评估可能的遗传连锁，并在必要时，在亲缘计算中实施考虑连锁位点的统计方法 [4], [5]。包括 FamLink2 [5], [6], [7] 和 KLINK [8] 在内的几个软件工具，允许将连锁 DNA 标记数据纳入 LR 计算。

在 DNA 混合样本解释中，主要的分析挑战之一是将结巴峰与次要贡献者的真实等位基因区分开来。由于结巴峰比率与重复单元长度成反比，五聚体微卫星通常比四聚体 STR 显示出较低的结巴峰比率 [9]，这可能有助于不平衡 DNA 混合物的解释。此外，包含高多态性标记可以通过增强对贡献者数量（NoC）的推断以及增加区分个体贡献者的能力来改善混合分析。

本研究的目的是开发和评估一种新型的五聚体 STR 面板，作为在常规 STR 试剂盒不能提供足够分辨能力情况下的补充工具。选择五聚体 STR 是因为其对法医遗传学特别相关的两个特征：高多态性和低结巴峰比率 [9]，两者在远程亲缘关系分析和 DNA 混合样本解释中均具有优势。基于已发布的高度多态性 STR 潜在列表 [10]，我们选择了具有最合适特征的位点来构建面板，包括五个在法医标记面板中以前未实施过的新五聚体 STR，以及 Penta E。包含后者是因为，尽管其高度多态性，但其相对较大的扩增子大小限制了其纳入商业试剂盒。

在此，我们报告了通过伊比利亚人群分析以及评估其在亲缘测试、混合样本解释和受损法医样本中的性能，对该新型 Penta-STR 面板的表征、优化和法医评估。

章节片段

候选法医用五聚体 STR 标记的选择

在本研究中，在仔细评估已发布的高度多态性 STR 潜在列表 [10] 后，选择了 26 个候选五聚体 STR 标记。标记选择基于以下筛选标准：

• i)
  根据公开可用数据观察到的最高多态性水平。
• ii)
  与常规案件鉴定中最常用的法医 STR 标记及扩展面板的遗传距离，应用最小距离为 12 Mb（此处用作厘摩 - cM 的代理）[11]

面板优化与性能评估

据我们所知，此处描述的新型多重检测系统中包含的五聚体 STR（Penta E 除外），以前未报道用于法医用途。该面板被设计为法医案件鉴定的补充工具。为此，基于预期的多态性和基因组位置，选择了六个五聚体 STR（表 1），确保它们位于距常用商业试剂盒中包含的法医 STR 至少 12 Mb 之外 [11]

结论与最后说明

开发了一种新型的五聚体 STR 多重检测系统，作为常规商业 STR 试剂盒的补充工具，特别侧重于具有挑战性的亲缘关系分析。该面板包括五个新选定的高多态性位点以及 Penta E，Penta E 是一种成熟的五聚体 STR，由于其相对较大的大小，未定期包含在商业 CE 试剂盒中。对来自伊比利亚半岛的 304 名个体的群体分析证实了所选位点的高多态性，具有

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致谢

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法医科学研究所法医遗传学单位，圣地亚哥 - 德孔波斯特拉大学，西班牙