《International Journal of Biological Macromolecules》：Structural characterization and immunomodulatory activity of a high-molecular-weight glucan-rich fraction from natural rubber serum
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研究人员从天然橡胶血清（natural rubber serum, NRS）中分离得到一种高分子量α-(1→6,1→3)-葡聚糖富集组分（HLPs-R10K）。该组分重均分子量（Mw）为285.5 kDa，具有三股螺旋（triple-helix）构象。在RAW
研究人员从天然橡胶血清（natural rubber serum, NRS）中分离得到一种高分子量α-(1→6,1→3)-葡聚糖富集组分（HLPs-R10K）。该组分重均分子量（Mw）为285.5 kDa，具有三股螺旋（triple-helix）构象。在RAW 264.7小鼠巨噬细胞中，HLPs-R10K可调控Toll样受体4（TLR4）与Dectin-1模式识别受体的表达，并调节核因子κB（NF-κB）与丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）信号通路。上述结果表明，工业NRS副产物可作为可持续的功能性多糖共产品开发来源。
研究背景与立项依据
天然橡胶胶乳（natural rubber latex, NRL）工业加工过程产生大量天然橡胶血清（NRS） aqueous by-product，传统上被视为高有机负荷、易微生物劣化的低值废水。已有研究多关注喷雾干燥NRS粉（NRSP）中的低分子量肽类与小分子（如双歧杆菌促生肽、5′-甲硫腺苷、白雀木醇），而对大分子多糖组分关注不足。前期过程开发研究表明，从工业NRS回收的水溶性橡胶树胶乳多糖（Hevea latex polysaccharides, HLPs）至少包含两个主要分子量群体，粗HLPs为异质性混合物；多糖生物活性受分子量、单糖组成、糖苷键型、分支架构及高级构象共同影响，因此需通过分级富集提升结构分辨率。本研究在10 kDa超滤截留（MWCO）集成生物精炼框架下，将粗HLPs划分为截留高分子量组分（HLPs-R10K）与透过低分子量组分（HLPs-P10K），聚焦结构富集的HLPs-R10K进行构效与巨噬细胞免疫调节评价。该研究发表于《International Journal of Biological Macromolecules》。
主要关键技术方法
研究人员以泰国宋卡Baan Hoo Rae橡胶合作社工业产线NRL为样本队列来源，经甲酸凝固辊压分离得到NRS；采用30 μm→1 μm→0.22 μm尼龙微滤澄清，继以10 kDa切向流超滤（TFF）20倍浓缩截留，5% TCA脱蛋白与乙醇沉淀获粗HLPs-R10K，再经透析与二次TCA/乙醇纯化。结构端使用HPSEC-MALLS测Mw/Rg、GC-MS甲基化分析糖苷键、600 MHz 1D/2D NMR（COSY/TOCSY/NOESY/HSQC/HMBC）定残基、刚果红碱梯度法判三股螺旋、SEM观形貌；免疫端以RAW 264.7细胞为模型，用WST-1测活力、Griess测NO、DCFH-DA测ROS、RT-qPCR测IL-6/iNOS/COX-2/TNF-α/IL-1β、Jess Western测p65/ERK/p-ERK/JNK/p-JNK、免疫荧光定量TLR4与Dectin-1。
研究结果
3.1.1 表征HLPs-R10K：经逐级纯化，纯化HLPs-R10K总糖79.15%、残蛋白0.38%，酶法葡聚糖43.92%（α-30.32%、β-13.60%）；HPSEC-MALLS得Mw 285.5 kDa、Rg 89.1 nm、PDI 1.21，RI色谱示主峰伴肩峰，证实为以高分子量葡聚糖为主但非绝对均一的富集分数。
3.1.2 单糖组成与结构分析：GC-MS仅检出葡萄糖；甲基化PMAA相对摩尔比示→6)-Glc
(1→占26.47、→3)-Glc
(1→ 2.86、末端Glc
(1→ 1.51、→3,6)-Glc
(1→ 1.00。1D/2D NMR指认四残基：A为α-D-(1→3)-Glc
、B为α-D-Glc
(1→、C为β-D-(1→3,6)-Glc
、D为α-D-(1→6)-Glc
；HMBC中D-C1/D-H6a,H6b及D-H1/D-C6相关支持主导(1→6)链接序列。综合判定HLPs-R10K为以α-(1→6)为主、含少量α-(1→3)及β-(1→3,6)分支的葡萄糖葡聚糖富集分数，非真菌β-葡聚糖框架。
3.1.3 构象分析：刚果红在NaOH梯度下λmax于中碱浓度出现红移峰值，提示有序螺旋-染料复合体形成，支持三股螺旋存在；SEM显示透析后颗粒表面纹理与聚集形态。
2.6/3.2 免疫调节活性：WST-1示透析HLPs-R10K在15.625–2000 μg/mL区间RAW 264.7存活率未受抑；Griess示其诱导NO呈浓度依赖而非LPS型强激活，PMB中和实验排除内毒素污染主导；DCFH-DA示ROS轻微上调。RT-qPCR示IL-6、iNOS、COX-2、TNF-α、IL-1β mRNA在低中浓度（15.625–250 μg/mL）适度上调、高浓度趋平。Western示p65、p-ERK、p-JNK磷酸化随125–1000 μg/mL处理增强，总ERK/JNK不变。免疫荧光示TLR4与Dectin-1膜定位荧光强度上调。结论为HLPs-R10K通过TLR4/Dectin-1协同门控调制NF-κB/MAPK，属稳态型免疫调节而非非特异性过度刺激。
讨论与结论浓缩
讨论指出，10 kDa超滤价值不在预设“高分子量=低分子量反向活性”，而在从原生NRS异质矩阵中划分结构相异多糖群体；HLPs-R10K低产率（0.005–0.01% w/v）反映其在NRS中本征丰度低而非工艺失效。α-(1→6)主导且含α-(1→3)的葡聚糖构型区别于蘑菇β-(1→3,1→6)葡聚糖与植物α-(1→4)淀粉，其来源可能为橡胶树乳管系统内源UDP-葡萄糖分流或内生真菌胞内储存葡聚糖贡献，但论文未以同位素标记确证。结论翻译：研究人员从工业NRS经10 kDa超滤富集获得高分子量（285.5 kDa）α-(1→6,1→3)-葡聚糖分数HLPs-R10K，具三股螺旋构象；该分数在RAW 264.7巨噬细胞中通过上调TLR4与Dectin-1表达、激活NF-κB与MAPK磷酸化级联，适度调控NO/ROS及IL-6/iNOS/COX-2/TNF-α/IL-1β表达，表现为可控免疫调节活性。该研究将NRS从废弃物重新定位为可持续功能性多糖共产品生物精炼原料，并证明膜分级可有效解析粗HLPs中的结构相异多糖群体。
