《International Journal of Biological Macromolecules》：Design, heterologous expression, and functional characterization of the
Salmonella-specific bacteriocin SalE1a
编辑推荐：
•密码子优化的 SalE1a 在大肠杆菌 BL21(DE3)/pLysS 中作为可溶性蛋白表达。•新型胞内结合提取简化并改善了 SalE1a 的纯化。•SalE1a 显示出强大的抗沙门氏菌活性，且不影响益生菌。•α-螺旋 SalE1a 破坏膜结构并触发活性氧介导的杀伤。•稳定
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密码子优化的 SalE1a 在大肠杆菌 BL21(DE3)/pLysS 中作为可溶性蛋白表达。
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新型胞内结合提取简化并改善了 SalE1a 的纯化。
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SalE1a 显示出强大的抗沙门氏菌活性，且不影响益生菌。
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α-螺旋 SalE1a 破坏膜结构并触发活性氧介导的杀伤。
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稳定、安全且符合 GRAS 标准的 SalE1a 在食品安全应用中前景广阔。
引言
沙门氏菌是肠杆菌科的一种革兰氏阴性杆菌，是全球食源性疾病的主要原因。拥有超过 2500 个血清型，沙门氏菌引起的疾病从胃肠炎到致命的伤寒不等。该属包括两个物种：鲍氏沙门氏菌和肠沙门氏菌；后者分为六个亚种。伤寒型血清型（肠沙门氏菌伤寒血清型，肠沙门氏菌副伤寒 A 血清型）引起全身性感染，而非伤寒型血清型（肠沙门氏菌肠炎血清型，肠沙门氏菌肠亚种鼠伤寒血清型）主要在人类和动物中引起胃肠炎 [1], [2]。全球范围内，沙门氏菌每年导致约 7870 万例疾病，包括美国约 135 万例病例和 420 例死亡 [3]。传播途径包括受污染的食物——如肉类、家禽、鸡蛋和蔬菜——或通过接触动物 [4]。发展中国家的卫生条件差增加了疾病的传播。自 2006 年以来，美国疾病预防控制中心 (CDC) 记录了 133 起多州爆发疫情，大多与食物有关 [5]。感染的严重程度取决于血清型、宿主免疫力和健康状况。伤寒型沙门氏菌可引起全身性、危及生命的疾病，而非伤寒型菌株主要引起胃肠炎以及易感个体的并发症 [6]。
沙门氏菌抗生素耐药性 (AR) 是一个新兴问题，由人类和动物中抗生素的滥用所驱动。多重耐药 (MDR) 菌株对四环素类、β-内酰胺类、喹诺酮类和氨基糖苷类具有耐药性 [7], [8], [9]，并通过受污染的食物、水和动物产品传播 [10]。根据欧洲疾病预防和控制中心和 CDC 提出的定义，MDR 定义为对三个或更多抗生素类别中至少一种抗菌剂不敏感。已在沙门氏菌血清型中报告了几种具有临床意义的 MDR 表型。最普遍的耐药模式之一是 ACSSuT 谱，其特征是对氨苄青霉素、氯霉素、链霉素、磺胺类和四环素耐药。另一种重要的表型是 MDR-AmpC 模式，赋予对多种 β-内酰胺和其他抗菌剂（包括氨苄青霉素、头孢西丁、头孢噻肟、氯霉素、链霉素、磺胺甲恶唑和四环素）的耐药性。这些耐药谱经常见于具有临床意义的血清型，如肠沙门氏菌鼠伤寒血清型、肠沙门氏菌肠炎血清型和肠沙门氏菌纽波特血清型 [11]。新的抗菌药物 [12] 以及诸如基于 CRISPR–Cas 的抗菌系统 [13], [14] 和噬菌体疗法 [15] 等方法的需求，是由多重耐药沙门氏菌增加住院率、治疗成本和死亡率这一事实所凸显的 [16]。
沙门菌素是天然存在的非抗生素蛋白，对广泛范围的沙门氏菌致病变异株表现出强效活性。这些蛋白是在沙门氏菌基因组数据库中鉴定的类似大肠菌素的细菌素 [17]。在细菌中表达沙门菌素经常导致细胞死亡或低产量，因为这些蛋白对许多细菌宿主有毒性。为避免细菌毒性，研究人员使用植物如本氏烟或菠菜，每公斤叶片可产生 1.2–1.7 克活性沙门菌素。尽管对于 E 型沙门菌素来说很少见，但其他（如沙门菌素 M）已在E. coli Rosetta (λDE3) 中表达。美国食品药品监督管理局 (FDA) 最近发布了沙门菌素（例如 SalE1a, SalE1b）在植物基系统中使用的“一般公认安全” (GRAS) 通知，该通知涵盖了 99 个血清型 [18]。正如在E. coli中沙门菌素 M 所展示的那样，微生物表达方法提供了可扩展、快速且廉价的重组生产 [19]。在此，我们报告了 SalE1a 在E. coli中的异源表达，并对其抗菌特性、作用机制、结构特征、稳定性和安全性档案进行了全面评估。本研究的具体目标是：(i) 在E. coli中克隆、表达和纯化重组 SalE1a，并评估胞内结合提取作为传统蛋白纯化方法的简化替代方案；(ii) 通过体外分析研究其抗菌功效、成孔机制、结构特征和理化稳定性；以及 (iii) 评估其安全性、选择性和宿主细胞耐受性，从而扩展对 SalE1a 生产和功能表征的当前理解。
章节摘要
计算机模拟生物信息学分析 SalE1a
我们检查了沙门菌素 (SalE1a) 序列 (NCBI 登录号：OIN35410.1) 的磷酸化位点 (NetPhos 3.1)、分子量和等电点 (ExPASy) [20]、结构域 (APD3) [21]、疏水矩 (HeliQuest) [21] 和疏水性 (ProtScale) [22]。使用 PSIPRED 和 GOR IV 估算二级结构；使用 TMHMM 2.0 [20] 预测跨膜结构域；使用 SWISS-MODEL 进行 3D 建模。抗菌倾向性 (AI4AMP)、抗真菌 (Antifp) [22]，
SalE1a 的生物信息学分析和计算机模拟功能见解
沙门菌素 E1a (SalE1a) 是一种 483 个氨基酸的蛋白 (NCBI 登录号：OIN35410.1)，预测分子量为 52.81 kDa，理论 pI 为 6.46 (补充表 1)。不稳定性指数为 24.93，将该蛋白归类为稳定，而亲疏水平均总值 (GRAVY) 得分为 ?0.436，表明整体呈亲水性。然而，使用 Kyte–Doolittle 亲疏水分析的亲疏水性分析揭示了一个朝向 C 端类似大肠菌素的明显疏水区域
结论
本研究成功展示了 SalE1a 在E. coli中的重组表达、纯化和综合功能表征。SalE1a 表现出强大且有选择性的抗沙门氏菌活性，良好的理化稳定性，以及可忽略的细胞毒性和溶血效应，支持其作为安全且有针对性的抗菌剂的潜力。机制研究通过膜破坏实验验证了其膜活性、成孔作用模式，
CRediT 作者贡献声明
Anagha Kalathil：撰写 – 初稿，验证，软件，资源，方法论，调查，数据整理。Kammara Rajagopal：撰写 – 审阅与编辑，验证，监督，资源，项目管理，调查，资金获取，概念构思。
致谢
作者感谢 CSIR-CFTRI 主任提供设施和支持。感谢 印度科学和创新研究委员会 (CSIR) 提供的奖学金给 AK。此外，衷心感谢位于班加罗尔的 国立生物科学研究所 (NCBS) 提供的流式细胞术设施和支持。作者还希望向 Arya S Kumar 女士表达感谢，感谢其细胞培养研究，向 Preetha C S 女士表达感谢，感谢其帮助使用 FPLC 系统，向 Aditya Rao S J 博士表达感谢
Anagha Kalathil|Kammara Rajagopal
