肽KF3和香叶醇对禾谷镰刀菌（F. graminearum ACCC 37687）的协同增效作用及其在玉米储存中的应用

《International Journal of Food Microbiology》：Synergistic effect of peptide KF3 and citronellal against F. graminearum ACCC 37687 and their application in maize preservation

　　

摘要

玉米面临由Fusarium graminearum引起的重大威胁，这种真菌会导致产量大幅减少，并产生具有免疫抑制作用的霉菌毒素脱氧雪腐镰刀菌烯醇（DON）的污染。本研究探讨了肽KF3与香叶醇联合使用对该病原体的抗真菌活性。KF3/香叶醇组合对其孢子表现出显著的协同效应（分数抑制浓度指数（FICI）=0.25），能够有效抑制菌丝伸展，并将液体培养中的菌丝生物量减少了79.97%，且在pH值变化、高温和离子胁迫条件下仍能保持稳定的效果。从机制上看，该组合加速了真菌死亡（Δ log?? > 8，仅用时12小时），抑制了生物膜的形成，并导致细胞膜严重受损；KF3介导的膜损伤促进了香叶醇的渗透，进一步加剧了细胞功能障碍。活性氧（ROS）的积累和呼吸链脱氢酶活性的抑制损害了能量代谢，同时全面抑制了核糖体的生物合成和蛋白质合成（3114个差异表达基因主要与核糖体和能量代谢途径相关），最终导致真菌死亡。值得注意的是，香叶醇减轻了KF3诱导的真菌耐药性，在经过30次连续传代后，KF3的最低抑制浓度（MIC）从64倍降低到8倍，这得益于该组合的低有效剂量和多靶点作用机制。体内实验验证了该组合能有效控制F. graminearum的污染，并降低了玉米中的DON水平，显示出在食品和饲料工业中用于谷物产后保存的巨大应用潜力。尽管其生产成本高于合成杀菌剂，但生物技术的进步有望缩小这一差距。

引言

Fusarium graminearum（以下简称F. graminearum）会引起镰刀菌头瘟病（FHB）（Del Ponte等人，2022年），并产生DON和玉米赤霉烯酮（ZEN），从而对小麦、大麦和玉米的产量造成重大损失，直接威胁食品安全。2020年的BIOMIN调查显示，玉米样本中同时含有FUM、DON和ZEN的比例分别为98%（亚洲）、97%（中美洲）和83%（南美洲），凸显了霉菌毒素的广泛污染（Dey等人，2023年）。像DON和ZEN这样的常见霉菌毒素会进入食物链，导致人类和牲畜出现恶心、呕吐、发烧和胃肠道不适（Alshannaq和Yu，2017年）。例如，2019年中国一所小学发生的食物中毒事件就是由受DON污染的商用生面条引起的（Ruan等人，2020年）。因此，制定有效的策略来减轻F. graminearum和霉菌毒素带来的健康风险至关重要。

化学控制仍然是管理F. graminearum的核心手段。然而，长期依赖单一作用机制会加剧抗性基因型的出现（Jayawardana和Fernando，2024年；Liu等人，2022年）。消费者对化学防腐剂的厌恶日益增强，加上对化学残留物和抗菌素耐药性的担忧日益严重，这使得开发天然（?ostar和Ristanovi?，2024年）和可持续的方法来控制F. graminearum及其霉菌毒素变得更为紧迫。

抗菌肽（AMPs）和植物精油（EOs）是两种最常被研究的绿色防腐剂。由于它们具有丰富的生物活性和天然的绿色来源，被认为是天然且安全的防腐剂，符合消费者对天然和安全食品的偏好（Sharma等人，2017年）。EOs具有抗菌、抗炎、抗氧化和抗肿瘤特性，通常被认定为安全物质（Ju等人，2019年）。研究表明，EOs能有效抑制食品中的霉菌：香叶醇和羟基香叶醇可以抑制新鲜农产品上的产后霉菌（De Oliveira等人，2020年），而柠檬醛和丁香酚可以防止Aspergillus niger在面包中的生长（Ju等人，2020年）。然而，它们的强烈气味和味道限制了其作为防腐剂的广泛应用。相比之下，AMPs是普遍存在于各种生物体中的天然免疫效应分子，通过破坏细胞膜和干扰代谢，对细菌、病毒、真菌、寄生虫和肿瘤细胞具有广谱抗菌作用（Li等人，2021年；Wang等人，2019年）。作为天然防腐剂，它们的有效性已在肉类食品、海鲜、烘焙食品和新鲜农产品中得到验证，且不会留下有毒残留物，因为它们在人体消化道内容易被分解（Doshna等人，2022年；Elidrissi等人，2023年；Liu等人，2008年；Roy等人，2024年；Sarika等人，2012年）。然而，高昂的合成成本和有限的可扩展性仍然是AMPs在食品系统中商业化应用的主要障碍。

EOs和AMPs的协同使用弥补了各自的局限性，能够在减少剂量的同时扩大抗菌谱，提供一种可持续的替代合成防腐剂的方法。实证研究表明，EOs与AMPs的联合使用可以在低于抑制浓度的情况下增强微生物抑制效果（Li等人，2022年）；例如，香芹酚和尼辛的组合显著延长了牛奶的保质期。先前的研究显示香叶醇（图1A）是增强抗菌肽对抗多重耐药细菌功效的强效增效剂（Yang等人，2023年）。AMP KF3（图1B）是一种含有赖氨酸、异亮氨酸、甘氨酸、苯丙氨酸和亮氨酸的酰胺化抗菌肽（Yang等人，2020年），但其协同作用尚未得到研究。为了将EOs-AMPs的协同作用应用于关键的谷物病原体，本研究首次评估了香叶醇与肽KF3联合使用对抗F. graminearum的效果。

章节片段

材料

F. graminearum ACCC 37687由中国农业微生物资源库购买。香叶醇（CAS：106–23–0，≥95%）由Jing zhu Bio（南京，中国）提供。AMP KF3（KIGKFLLFKGIKKIGKFL-NH₂）由Jie Peptide Biotechnology Co., Ltd.（南京，中国）合成。高效液相色谱（HPLC）和基质辅助激光脱附离子化质谱（MALDI-TOF MS）确认了其质量和纯度≥95%。马铃薯葡萄糖琼脂培养基（PDA）和马铃薯葡萄糖肉汁培养基（PDB）由Aoboxing Biotechnology Co., Ltd.（北京，中国）提供。

抗真菌活性和协同抗真菌效应

最小抑制浓度（MIC）值反映了抗真菌活性：KF3在4 μM浓度下就能抑制F. graminearum，而香叶醇则需要4096 μM。棋盘实验显示了强烈的协同效应（FICI = 0.25；表1），0.5 μM KF3与512 μM香叶醇联合使用可完全抑制真菌生长——每种化合物的剂量减少了8倍（图2 A）。

杀菌动力学曲线

杀菌动力学曲线见图2 B。单独使用KF3或香叶醇仅能产生短暂的杀菌效果，之后会发现真菌再次生长。

讨论

由于镰刀菌头瘟病（FHB）和脱氧雪腐镰刀菌烯醇（DON）等trichothecene霉菌毒素的污染，F. graminearum对全球粮食生产和食品安全构成了严重威胁。虽然合成杀菌剂仍然是主要控制手段，但抗性的出现、环境持久性和严格的残留物法规使得寻找环保替代方案的需求日益迫切（?ostar和Ristanovi?，2024年）。像EOs和AMPs这样的天然替代品具有天然的生物降解性和低毒性，然而它们单独使用时效果有限……

结论

本研究表明KF3和香叶醇对F. graminearum ACCC 37687具有显著的协同抑制作用（FICI = 0.25），两种物质的MIC均降低了8倍。从机制上看，这种组合通过相互增强作用发挥作用：香叶醇破坏生物膜和膜通透性，促进KF3的渗透；而KF3引起的膜损伤使香叶醇能够进入细胞内部，形成一个自我放大的级联反应，最终导致核糖体生物合成、中心代谢和氧化还原反应的崩溃……

CRediT作者贡献声明

Yingxin Wei：撰写初稿、方法学研究、数据分析、概念构思。Zhanyi Yang：审稿与编辑、验证、方法学研究、数据分析。Xiangwan Wang：数据管理。Baojing Cheng：数据可视化与软件处理。Anshan Shan：项目监督、资源协调、资金争取、概念构思。

利益冲突声明

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致谢

本研究得到了中国国家自然科学基金（编号：32272914和U25A20708）、中国国家重点研发计划（编号：2022YFD1300700）、黑龙江省合作创新成果项目（编号：LJGXCG2022-022）以及黑龙江省优秀博士论文基金（编号：LJYXL2023-091）的支持。

Yingxin Wei|Zhanyi Yang|Xiangwan Wang|Baojing Cheng|Anshan Shan东北农业大学动物科学技术学院，哈尔滨，150030，中国