引言
〈section id="sec1">
神经营养因子（NGF）是最早被发现的神经营养因子，是一种分泌的生物活性蛋白，在神经元存活、分化、神经突起延伸和感觉神经元维持中起着重要作用。其高亲和力的受体——原肌球蛋白受体激酶A（TrkA）在配体结合后会激活MAPK/ERK、PI3K/Akt、PLCγ及相关细胞内信号通路[1]。除了经典的神经营养功能外，NGF还参与上皮修复、伤口相关重塑以及在需要神经生长和局部营养支持的组织过程中的作用[2]。因此，重组NGF被广泛用于研究神经元分化、营养活性、上皮修复和神经再生相关过程。
Cenegermin是一种重组人NGF眼科制剂，用于治疗神经营养性角膜炎，相关研究考察了重组NGF在眼表修复和角膜神经恢复中的作用[3, 4, 5, 6]。在犬中，局部应用NGF已用于实验性干眼症的防治；含有NGF的胶原导管已被测试用于坐骨神经损伤的治疗；质粒介导的犬β-NGF递送方法也在感觉神经病变模型中进行了研究[7, 8, 9, 10, 11]。这些研究表明，需要能够可重复生产并经过受体结合和NGF相关生物活性验证的重组犬NGF制剂。
生物活性NGF的生产在技术上仍具有挑战性。早期用于研究和临床应用的NGF制剂是从鼠下颌腺中提取的。与重组生产相比，从动物组织中纯化的制剂成分不明确，且可能受到来源可用性、批次间一致性和生物原材料质量的影响[12]。重组表达提供了更可控的NGF制备方法，但表达宿主和分子形式仍然重要。成熟的NGF是一种富含半胱氨酸的同二聚体，其活性取决于正确的折叠、二硫键形成、半胱氨酸结结构以及受体结合表面的完整性[1, 14]。细菌表达系统可以生产NGF，但不溶性包涵体以及体外重折叠可能影响生物活性成熟蛋白的回收。哺乳动物表达系统更适合分泌型、含二硫键的蛋白质的生产，常用于需要正确折叠、组装和翻译后处理的重组蛋白[12, 15]。因此，重组NGF的质量不能仅通过表达水平或免疫反应性来判断；还需要考虑分子形式、纯化策略和功能验证。
Fc融合体在重组蛋白设计中被广泛应用，因为它可以促进亲和纯化、免疫检测、分子稳定，并在某些情况下延长系统暴露时间[16, 17, 18]。然而对于NGF来说，Fc融合体不能简单地视为一个纯化标签。成熟的NGF是一种二聚体配体，通过特定的受体结合表面与TrkA结合，连接子的设计、Fc介导的双价性以及空间排列可能会影响受体的可及性和下游信号传导[13, 16, 19]。因此，对于任何NGF-Fc形式而言，功能验证都是必不可少的。
在这项研究中，使用稳定的CHO细胞系统表达了编码全长犬前体NGF前体基因并将其与犬IgG的Fc区域融合的犬NGF-Fc构建体。预期在分泌过程中通过蛋白酶促成熟生成含成熟NGF的融合产物（命名为cNGF-Fc）。分泌蛋白通过Protein G亲和纯化从培养上清液中回收，并通过SDS-PAGE和Western blotting进行检测。其生物活性进一步通过TrkA-ECD结合ELISA、TF-1细胞增殖实验、PC12神经突起生长实验和ERK磷酸化实验进行评估。这项工作建立了一种稳定的基于CHO的生产和功能验证流程，用于生产与物种匹配的犬NGF-Fc融合蛋白。
