空肠弯曲菌天然膜中外膜蛋白PorA、OMP50与Cj0034c的结构洞察

《PLOS Biology》：Structural insights into the outer membrane proteins PorA, OMP50 and Cj0034c from native Campylobacter jejuni membranes

　　

细菌外膜蛋白（OMPs）是宿主-病原体互作与环境适应中的关键角色。研究人员在此描述了新开发的“从脂质环境中梯度富集天然靶标”（GENTLE）方法，并利用该方法直接从天然、去垢剂增溶的粗膜中解析空肠弯曲菌（Campylobacter jejuni）OMPs的结构。研究人员鉴定并解析了来自C. jejuni膜的PorA、OMP50和Cj0034c的高分辨率冷冻电镜结构，这些蛋白均参与弯曲菌的侵袭、黏附及宿主感染起始。值得注意的是，结果提供了OMP50的首个结构信息，揭示其由全β链跨膜域与全α螺旋周质域构成的两域架构；该结构显示所有酪氨酸残基（其中许多预期对磷酸化及宿主-病原体互作至关重要）定位于C. jejuni外膜。研究还获得全长Cj0034c蛋白的首个结构，其以九聚体组装，每个原聚体含单跨膜α螺旋及大周质域，九个原聚体侧边堆叠形成跨越整个脂双层的通道；然而Cj0034c究竟跨越外膜（OM）还是内膜（IM）尚需实验验证。此外，研究人员观察到PorA表面暴露的胞外环L4极具柔性，这可能对该孔蛋白毒力至关重要。综上，本工作为功能重要OMPs提供新结构信息，并阐明其在天然细菌膜中的组装方式，进一步证明无需过表达与纯化即可从粗天然膜中获取靶向膜蛋白高分辨率结构的可能性。

研究背景与立项依据

空肠弯曲菌（Campylobacter jejuni）是全球领先食源性病原体，年致逾4亿腹泻病例，且抗生素耐药株已被美国CDC列为严重耐药威胁。革兰氏阴性菌外膜（OM）是宿主界面核心层，孔蛋白（porins）调控通透性；其中PorA（即MOMP）为最主要孔蛋白，OMP50（即CjTK）兼作酪氨酸激酶，Cj0034c（即CjSLP）为黏附因子，三者均关乎定植与毒力。然而传统膜蛋白结构解析依赖过表达与繁琐纯化，所得化学计量、寡聚态常存争议。为在原位天然态下获取高分辨结构，研究人员开发GENTLE法并结合前期BaR（Build-and-Retrieve）冷冻电镜策略，直击C. jejuni NCTC 11168粗膜。

主要关键技术方法

研究人员采用C. jejuni NCTC 11168临床标准株为样本队列，经法国压破碎获粗膜，LMNG去垢剂增溶后行蔗糖垫超速离心富集；质谱确认靶蛋白存在；样品上载多孔碳载网行单颗粒冷冻电镜（cryo-EM）采集（Titan Krios 300 kV/K3），以BaR流程做in silico分类与粒子检索，DeepTracer鉴名，Coot/PHENIX精修，整体构成GENTLE方法论。

研究结果

“Gradient Enrichment of Native Targets from Lipid Environments”（GENTLE）methodology

经蔗糖垫富集与BaR分类，从同一粗膜样本同时分出三类粒子，分别对应PorA、OMP50、Cj0034c，证明免过表达直取天然膜结构可行。

PorA/MOMP

解析PorA-I（2.47 ?）与PorA-II（2.74 ?）两构象，均为三聚体，每原聚体18链β桶（β1–β18），桶内L3/L4/L7伸入孔道并锚定Ca²⁺（D142/Q174/D177/E307配位）。PorA-II缺失L4（171–191）密度且无Ca²⁺，表明L4柔性受Ca²⁺调控。L4为表面暴露环，含空肠弯曲菌高毒力SA克隆9/18突变位点，关联系统性扩散与流产表型；孔道内负电，利于阳离子底物转运。

OMP50/CjTK

首解OMP50-I（2.82 ?）与OMP50-II（2.81 ?）三聚体。每原聚体16链β桶加N端44残基α1螺旋，三α1成周质天线状卷曲螺旋；27个酪氨酸全布于OM侧β桶，Y147/Y204/Y360/Y399衬孔，Y204闭孔，呈阳离子选择性。OMP50-II仅见α1的C端（63–79），N端（36–62）柔性无序，暗示周质域构象切换参与磷酸酪氨酸信号。OMP50为孔蛋白兼酪氨酸激酶，控胶囊多糖合成。

Cj0034c/CjSLP

首解全长Cj0034c九聚体（3.13 ?）：每原聚体单跨膜α螺旋（6–34）加大周质域（D1四β一α、D2五β二α），九聚成门钮状跨膜通道，腔内正电。该蛋白既往被认为成熟后入周质，本结构证其为整合膜蛋白；但是跨OM还是IM未定，若跨OM则成革兰氏阴性菌首例全α螺旋跨膜OMP。

讨论与结论翻译

C. jejuni OMPs为黏附、信号转导核心毒力因子。GENTLE法同步解析PorA、OMP50、Cj0034c天然态结构，提供OMP50激酶与全长Cj0034c黏附因子首结构，并揭示天然寡聚态。Cj0034c九聚通道跨膜层未明（IM或OM待验），若跨OM将改写革兰氏阴性OMP仅β桶范式。OMP50双域架构将所有酪氨酸定位于OM，周质α束柔性或应ROS抑磷酰网络。PorA-L4柔性及Ca²⁺结合关联高毒力与碳青霉烯耐药。GENTLE耦合蔗糖垫与BaR，可推至低丰度膜蛋白及跨膜复合体，免交联修饰，为原核/真核包埋膜蛋白药靶解析开新径。

论文发表于《PLOS Biology》。