STRIPAK相关“绿胡子”蛋白DOC1和DOC2调控大孢粪壳菌MAK2信号及有性发育

《PLOS Biology》：STRIPAK-associated greenbeard proteins DOC1 and DOC2 regulate MAK2 signaling and sexual development in Sordaria macrospora

　　

摘要翻译：丝状真菌的菌丝融合和有性发育依赖于多个保守节点的协同信号传导，例如striatin相互作用磷酸酶和激酶（STRIPAK）复合物以及信息素响应（PR）MAP激酶级联（MIK2、MEK2、MAK2、HAM5）。本研究利用同宗配合子囊菌大孢粪壳菌（Sordaria macrospora，Sm）筛选SmSTRIPAK复合物的推定蛋白互作因子。研究人员以该复合物的STRIPAK复合物互作因子1（SCI1）亚基为诱饵，富集并鉴定了典型的SmSTRIPAK组分以及一种通讯决定（DOC）蛋白。DOC蛋白此前在亲缘关系密切的异宗配合物种粗糙脉孢菌（Neurospora crassa）中被描述，功能涉及幼殖体及菌丝融合的同种异体识别。研究人员在大孢粪壳菌中构建了ΔSmdoc1、ΔSmdoc2单缺失菌株以及ΔSmdoc1ΔSmdoc2双缺失突变体。缺失表型呈现悖论：单敲除（ΔSmdoc1或ΔSmdoc2）几乎不育，有性发育受损，而双突变体（ΔSmdoc1ΔSmdoc2）表现出野生型育性和发育，证明二者功能非冗余且相互拮抗。通过在内源基因座进行基因标记，研究人员以SmDOC1和SmDOC2为诱饵进行了基于TurboID的邻近标记。该邻近标记显示SmDOC1/2与PR MAP激酶通路组分紧密关联，并揭示SmDOC1–SmDOC2之间存在相互邻近关系。以SmDOC1进行的酵母双杂交实验确认了其与MAP激酶MEK2和MAK2的直接互作。荧光显微观察显示SmDOC1-TagRFP-T定位于隔膜孔附近的结构。研究结果表明，DOC系统不仅局限于异宗配合的粗糙脉孢菌，也在同宗配合真菌大孢粪壳菌的子实体发育中发挥重要作用。这些发现提示DOC1/2蛋白是一个整合STRIPAK与PR通路的新型系统，为其缺失菌株的非加性表型提供了可能的机制解释。

论文解读文章：

研究背景与科学问题：在丝状真菌中，菌丝融合和有性发育依赖于高度保守的信号调控网络。其中，striatin相互作用磷酸酶和激酶（STRIPAK）复合物与信息素响应（PR）MAP激酶级联是两类关键调控模块。STRIPAK复合物是多亚基磷酸酶组装体，在真菌中调控子实体形成、细胞融合、营养及有性发育等过程；PR通路则由MIK2、MEK2、MAK2及支架蛋白HAM5组成的三层MAP激酶级联构成，调控有性发育、菌丝融合和黑色素依赖性子囊孢子萌发。尽管已有证据表明STRIPAK与PR通路之间存在双向串话，但二者间的分子连接机制尚不完全清楚。在大孢粪壳菌（Sordaria macrospora，Sm）中，SmSTRIPAK复合物已被研究二十余年，但其邻近蛋白网络尚未被系统绘制。此前在粗糙脉孢菌（Neurospora crassa）中发现的“绿胡子基因”doc-1、doc-2和doc-3编码通讯决定（DOC）蛋白，调控幼殖体长距离自我/非我识别，并与MAK2共振荡。然而DOC系统在同宗配合真菌中的作用及其与STRIPAK和PR通路的关联尚属未知。因此，研究人员开展了本项研究。

研究内容与结论：研究人员利用生物素鉴定（BioID）邻近标记结合质谱技术，以SmSTRIPAK复合物亚基SCI1为诱饵进行无偏筛选。在SCI1-BioID实验中，除已知SmSTRIPAK组分（PRO11、SmMOB3、PRO22）外，显著富集到粗糙脉孢菌“绿胡子蛋白”DOC-2的同源蛋白SmDOC2，并鉴定了其相邻基因编码的SmDOC1。研究人员在大孢粪壳菌中构建了ΔSmdoc1、ΔSmdoc2单缺失和ΔSmdoc1ΔSmdoc2双缺失菌株，发现单敲除菌株有性发育严重受损，仅产生少量子实体，而双敲除菌株表现出与野生型相似的育性和发育，证明SmDOC1和SmDOC2功能非冗余且相互拮抗。通过内源基因座标记，研究人员构建了SmDOC1-TurboID和SmDOC2-TurboID融合菌株，进行邻近标记实验，发现两个蛋白的邻近组均显著富集PR通路组分（HAM5、MEK2、MAK2），并存在SmDOC1与SmDOC2的相互富集。酵母双杂交（Y2H）实验证实SmDOC1可直接与MEK2-t1、MEK2-t2和MAK2互作。荧光显微镜显示SmDOC1-TagRFP-T定位于成熟菌丝隔膜中心（隔膜孔附近），而SmDOC2的荧光定位信号较弱，难以与自发荧光区分。相比之下，研究人员对粗糙脉孢菌的doc敲除菌株进行有性发育分析，发现DOC-1和DOC-2对粗糙脉孢菌的有性生殖非必需。这些结果表明DOC系统不仅限于异宗配合的粗糙脉孢菌，也在同宗配合的大孢粪壳菌子实体发育中发挥关键作用，并提示SmDOC1/2可能作为连接STRIPAK与PR通路的新型调控节点。

主要技术方法：本研究主要采用了以下关键技术方法：（1）基于TurboID的BioID邻近标记结合液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）鉴定蛋白邻近组；（2）酵母双杂交（Y2H）验证蛋白直接互作；（3）靶向基因敲除与同源重组构建缺失菌株（在大孢粪壳菌Δku70或Δku80背景下，经fus1-1颜色孢子突变体杂交获得单孢子分离株）；（4）荧光显微分析（TagRFP-T和EGFP标记）；（5）蛋白质印迹（Western blot，链霉亲和素-HRP检测生物素化蛋白）。此外，研究使用了粗糙脉孢菌Δdoc-2菌株（来源于Louise Glass实验室）进行遗传杂交。

研究结果（分节概述）：
1. SCI1-BioID实验鉴定SmDOC2为推定的SmSTRIPAK互作蛋白：以SCI1为诱饵进行两组独立BioID实验（分别以游离TurboID和Δpro11背景为对照），均显著富集SmDOC2，且SmDOC2的富集不受pro11缺失引起的蛋白质组变化影响。
2. Smdoc1和Smdoc2缺失损害有性发育：ΔSmdoc1和ΔSmdoc2单敲除菌株子实体形成严重受损，多数有性结构停留在原分生孢子器阶段；双敲除ΔSmdoc1ΔSmdoc2则表现野生型样育性。单敲除菌株的菌落建立延迟，但一旦建立后营养生长速率与野生型相当。回补实验恢复了单敲除菌株的子实体形成能力。
3. 粗糙脉孢菌中DOC-1和DOC-2在有性发育中非必需：对N. crassa的Δdoc-1、Δdoc-2和Δdoc-1Δdoc-2菌株进行有性杂交，所有突变体均能正常形成原分生孢子器并在受精后产生子囊孢子，说明DOC蛋白在粗糙脉孢菌有性生殖中不发挥必要作用。
4. SmDOC1/2邻近组包含MAK2 MAP激酶级联组分：SmDOC1-BioID显著富集HAM5、MEK2、YAK1、SMAC_05428等；SmDOC2-BioID显著富集MAK2、MEK2、SmMOB3、PTPA1、DSK1、SIR2等。两种诱饵相互富集对方。在Δmak2背景下进行的SmDOC2-BioID中，多数富集蛋白（SIR2、SmDOC1、DSK1、MEK2、SmMOB3、PTPA1、HRR25）的富集不受影响。
5. SmDOC1/2-BioID富集两种MEK2异构体：研究发现SmDOC1和SmDOC2的邻近组均富集MEK2-t1和MEK2-t2（一种通过内含子保留产生的延长C端异构体），且MEK2-t2肽段仅在BioID洗脱液中检测到，对照和输入对照中未检出。
6. SmDOC1与PR信号通路组分物理互作：Y2H实验表明AD-SmDOC1与BD-MEK2-t1、BD-MEK2-t2和BD-MAK2均能互作，但与BD-HAM5无互作（可能因BD-HAM5融合蛋白非功能性）。SmDOC2因对Y2H系统表现出毒性/不相容而无法测试。
7. SmDOC1定位于隔膜孔：SmDOC1-TagRFP-T融合蛋白在成熟菌丝的所有隔膜中心显示弱但清晰的特异性荧光信号，而野生型对照在隔膜中心无信号；SmDOC2的egfp和TagRFP-T标记菌株仅观察到可归因于自发荧光的微弱信号。

讨论与结论：本研究的SCI1邻近组数据捕获了SmSTRIPAK与已知信号通路（如隔膜起始网络SIN、MAPK信号、核糖体生物发生）的关联，并支持STRIPAK作为信号枢纽的作用。SmDOC系统在异宗配合的粗糙脉孢菌和同宗配合的大孢粪壳菌中表现出相似的非加性敲除表型，提示存在保守机制——需要平衡的DOC相互作用以在粗糙脉孢菌营养生长期间或在大孢粪壳菌早期有性发育中维持正常菌丝融合。基于SmDOC1的隔膜孔定位及其与PR组分（MEK2、MAK2、HAM5）的邻近和直接互作，研究人员提出了一个假设性模型：在失活状态，SmDOC1和SmDOC2相互抑制；信息素信号触发PR MAPK级联组装和磷酸化，激活的MAK2可能磷酸化并激活SmDOC1/2，后者与MEK2、MAK2和HAM5结合，促进PR信号复合物拆卸并终止信号；随后SmSTRIPAK磷酸酶使SmDOC1/2和PR组分去磷酸化，使系统恢复初始状态。该模型可以解释Smdoc敲除的非加性表型，但需要未来实验验证，特别是时间动态方面可能需要split-BioID等更高时间分辨率的方法。研究结论：DOC系统并非局限于异宗配合真菌粗糙脉孢菌，而同源蛋白SmDOC1/2在同宗配合的大孢粪壳菌子实体发育中发挥关键作用；SmDOC1/2可能作为整合STRIPAK与PR MAPK通路的新型调控系统，通过相互拮抗和与PR组分互作调控有性发育。