《ACS Infectious Diseases》：Advancing Tuberculosis Antigen Detection by Selecting Sandwich-Compatible Aptamers Against the Mycobacterium tuberculosis ESAT-6/CFP-10 Heterodimer Using Library-Immobilized Strategies
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结核病（Tuberculosis, TB）是全球领先传染病致死病因，超过COVID-19。尽管可防可治，仍有大量病例未被诊断或报告，持续传播。检测感染各阶段分泌的抗原如结核分枝杆菌ESAT-6/CFP-10异二聚体是颇具前景的筛查策略。传统依赖抗体的抗原检测在
结核病（Tuberculosis, TB）是全球领先传染病致死病因，超过COVID-19。尽管可防可治，仍有大量病例未被诊断或报告，持续传播。检测感染各阶段分泌的抗原如结核分枝杆菌ESAT-6/CFP-10异二聚体是颇具前景的筛查策略。传统依赖抗体的抗原检测在特异性和敏感性上存在显著问题。适配体（aptamer）通过体外SELEX（Systematic Evolution of Ligands by EXponential enrichment）技术筛选获得，是可折叠为独特三维结构、以高亲和力和高特异性结合蛋白质、细胞或小分子等靶标的短单链寡核苷酸。然而常规SELEX常因靶标固定导致非特异性相互作用和蛋白质构象扭曲而产出次优适配体。研究人员采用两种文库固定策略生成靶向M. tuberculosis ESAT-6/CFP-10异二聚体的适配体。首先进行capture-SELEX筛选溶液中无约束、天然构象异二聚体的适配体；随后以靶标特异性抗体“诱钓”适配体-靶标复合物，开展第二轮SELEX，分离夹心兼容适配体用于下游分析开发。所得适配体无论文库与筛选策略均表现出高纳摩尔亲和力，bait-SELEX衍生候选者在更少轮次后出现。这些适配体成功应用于抗体/适配体杂化夹心分析，支持其在非痰标本TB抗原检测中的潜力。
研究背景与立项依据
结核病由结核分枝杆菌（Mycobacterium tuberculosis）引起，2024年全球约10.7亿人感染、123万人死亡，仍是单一传染源头号死因。现行诊断依赖结核菌素皮肤试验（TST）、干扰素γ释放试验（IGRAs）、痰涂片抗酸染色及培养金标准，分子法如Xpert MTB/RIF受成本与基建限制难以覆盖高负担低资源地区。抗原检测尤以非痰标本（尿液等）中ESAT-6/CFP-10异二聚体为潜在标志物，但传统抗体试剂存在成本高、动物生产周期长、标记修饰难等问题。适配体作为核酸识别分子具备可编程、易合成修饰、适配多平台优势，而常规SELEX将靶标固定于固相易改变异二聚体构象，多聚体靶标筛选效率低。该研究发表于《ACS Infectious Diseases》，旨在以文库固定策略保持靶标天然构象并正向富集可形成抗体/适配体夹心的序列，为点-of-care（PoC）抗原检测提供新工具。
主要关键技术方法
研究并行使用CS3（98 nt，两段随机区10 nt与40 nt间夹12 nt docking site）与CS4（66 nt，单段N30随机区）两种ssDNA文库；以重组表达纯化ESAT-6与CFP-10于中性pH形成异二聚体；capture-SELEX通过生物素捕获探针将文库杂交固定于链霉亲和素磁珠，靶标留于溶液，经负选、正选、升温预洗脱释放靶结合序列；bait-SELEX在capture基础上，将洗脱的适配体-靶标复合物与固相化抗CFP-10多克隆IgG孵育，仅共结合于非重叠表位的夹心兼容适配体被甘氨酸洗脱；筛选进程由pilot PCR、qPCR、熔解曲线监控，NGS（Ion Torrent）分析富集，Mfold预测二级结构，ELAA（酶联适配体分析）初筛，BLI（生物膜干涉）测动力学，最终以ELAASA（酶联抗体/适配体杂化夹心分析）验证检测限。
研究结果
制备重组ESAT-6与CFP-10及其异二聚体：SDS-PAGE确认纯度>90%，native PAGE显示中间迁移率条带，色氨酸内源荧光由单体347–351 nm蓝移至异二聚体341 nm，证实体外异二聚体形成。
开发文库固定SELEX流程：capture-SELEX进行11轮、bait-SELEX进行6轮（前4轮与capture共享scouting），CS3文库经内部docking site固定，CS4经反向引物区固定，逐步提升严谨度（降靶浓度、降文库量、缩孵育时间）。
监测筛选进程与文库多样性：qPCR显示CS3前三轮回收率高，熔解曲线Tm由66 ℃升至77–81 ℃，峰形变锐提示富集收敛；CS4无显著Tm漂移、回收率低，表明分段长随机区提供更高构象空间。NGS显示CS3捕获库富集序列占比自R4约4%升至R11近60%，CS4末轮仅20%；bait库经抗体诱钓后独特序列骤减、富集物种上升，平均GC由52%降至46%。
NGS分析与候选确定：自末轮靶洗脱池按丰度与Mfold ΔG选17条代表序列（capture 10条、bait 7条），MEME未现保守基序，CS3候选随机核独立成环，CS4候选引物臂参与折叠。
适配体候选筛选：ELAA中capture源HC309p（CS3）、HC4133p（CS4）信号最高；bait源HP301p（CS3）、HP414p/HP419p/HP429p（CS4）更高；抗CFP-10包板夹心ELAA中HP301p与HP412p最强，选其进入表征。
亲和力测定：间接ELAA得HC309p KD 100.2 nM、HC4133p 273.4 nM、HP301p 232.3 nM、HP412p 91.8 nM；BLI（适配体固相化）得424、356、396、348 nM，kon 1.0–1.2×105 M–1s–1，koff 4.0–4.7×10–4 s–1，低解离率示稳定复合体，固相化致BLI值略高。
生物基质结合活性：人尿稀释液中四候选结合异二聚体信号无显著损失，提示适于尿液TB诊断。
杂化夹心分析检测：以抗CFP-10多克隆抗体包板捕获，生物素化HP301p或HP412p（1 μM）联合链霉亲和素-polyHRP报告，靶标312 nM–20 μM范围内构建标准曲线，LOD分别为188 nM（4.3 ng·μL–1）与1178 nM（26.7 ng·μL–1）。
讨论与结论翻译
讨论指出，相较既往filter membrane SELEX（仅识CFP-10亚基，KD 1.6–21.5 nM针对单体）与microplate SELEX靶向单链融合CE蛋白（KD 160–375 nM），本研究以文库固定保持“天然样”异二聚体，所获适配体KD处高纳摩尔级，ELAA与BLI差异源于表面吸附表位暴露或传感器空间位阻，非序列本身缺陷。CS3分段随机区设计近似BANK-S4，优于CS4连续N30，印证随机区长度与分段对蛋白多聚体适配体进化至关重要。bait-SELEX借抗体空间位阻正向选择非重叠表位，轮次更少即出夹心兼容体。
结论：研究人员通过capture-SELEX与新型bait-SELEX两级文库固定管线，筛选出靶向M. tuberculosis ESAT-6/CFP-10异二聚体、具高纳摩尔亲和力且可用于抗体/适配体杂化夹心格式（ELAASA）的适配体，HP301p与HP412p在尿液基质中保持稳定结合，证明文库固定策略能规避靶标固相变形、高效产出诊断级夹心兼容核酸识别分子，为非痰标本结核病抗原PoC检测提供可合成、易修饰的替代生物受体。
