软材料红外纳米光谱的液相样品环境研究

《Analytical Chemistry》：Understanding In-Liquid Sample Environments for Infrared Nanospectroscopy of Soft Materials

　　

近年来，散射型扫描近场光学显微镜（s-SNOM）的进展使得在水相原生环境中以纳米空间分辨率对生物分子与细胞进行无标记红外（IR）光谱分析成为可能。该能力通过超薄膜实现，薄膜阻止原子力显微镜（AFM）探针与液体直接接触，同时允许倏逝光场探测下方样品。在此构型中，薄膜影响显微镜的远场与近场响应，因此在诠释近场相互作用时需将多层样品体系纳入考虑。研究人员对超薄氮化硅（SiNx）与碳化硅（SiC）薄膜进行了系统研究，考察其在干燥条件及与牛血清白蛋白（BSA）和DNA分子水溶液接触时的近场光学响应。此外，研究人员演示了在SiNx膜下液相环境中对α-突触核蛋白原纤维聚集体的纳米尺度IR（nano-IR）成像与光谱。结果表明，薄膜材料不仅影响可用透明窗口，还引入由薄膜光学性质及样品对基底粘附决定的光谱变化。进一步，研究人员显示有限偶极模型（FDM）可复现膜-生物分子堆叠样品的近场光谱，为诠释实验nano-IR结果提供一致框架。该比较研究为选取中红外s-SNOM液相实验薄膜材料提供见解，凸显SiNx与SiC的优势与局限，并指出伪影来源及与理想模型偏差的潜在因素。

研究背景方面，散射型扫描近场光学显微镜（s-SNOM）可在可见光至太赫兹范围以约10 nm空间分辨率获取材料局域介电信息，但多数实验在干燥条件下进行；生物体系分子结构与相互作用常只在原生水相中保持，而水的强中红外吸收阻碍传统透射，液相AFM-IR又受悬臂阻尼与水吸收限制。为在液相中实现nano-IR，学界提出全内反射（TIR）棱镜与超薄透明膜两类方案，膜方案以SiN_x、SiC、石墨烯等隔离AFM探针与液体，避免探针污染与振荡阻尼，但膜本身的电磁响应（透明窗口与表面声子极化激元SPhP）会重塑近场对比度与光谱，带来诠释难题。该研究即系统量化SiN_x与SiC膜在干态及水相（含BSA、DNA、α-突触核蛋白原纤维）下的近场行为，并以有限偶极模型（FDM）建立多层膜堆叠诠释框架，论文发表于《Analytical Chemistry》。

关键技术方法上，研究人员采用Attocube neaScope耦合BESSY II同步辐射IRIS束线宽带光源（800–2000 cm^–1），以Pt-Ir镀层硅AFM探针在轻敲模式第二谐波（2Ω）解调获取s-SNOM振幅s₂与相移φ₂；薄膜为Norcada 10 nm SiN_x与Silson 30 nm 3C-SiC自支撑膜，液相池由铝夹持器与等离子体亲水化处理构建；远场以Bruker Vertex 70v FTIR测500 nm厚膜反射提取介电函数（Focus 2.0 Lorentzian拟合），以Ge棱镜ATR获取BSA/DNA水溶液谱；近场模拟用开源Python包snompy基于FDM，将体系建模为空气/膜/分子层/水/Si+2 nm SiO₂多层栈，探针取椭球（r=60 nm，L=200 nm）。样本包括商业化BSA（0.55 g/mL）与鲑鱼精子DNA（1% w/w），以及从E. coli BL21(DE3)表达纯化、37 °C 800 rpm震荡144 h聚集的野生型α-突触核蛋白（50 μM于磷酸钾缓冲液）。

研究结果部分，首先于“自由站立SiN与SiC膜的近场光学性质”小节，干态下两相移谱在SiN的985与1130 cm^–1、SiC的875与965 cm^–1处出现SPhP共振，位于各自Reststrahlen带；FDM可定性重现多峰分裂，峰位偏差源于偶极模型忽略SPhP非局域性，SiN透明区>1300 cm^–1，SiC透明区>1050 cm^–1。继而“通过超薄膜在水相环境中获取生物分子光谱”小节中，水下层使膜SPhP红移（水介电负载），OH弯曲模在SiN下1648 cm^–1、SiC下1641 cm^–1，且随膜厚增加红移、SiC较SiN同厚时峰更低；BSA经水归一后，SiN下酰胺I 1652 cm^–1/酰胺II 1545 cm^–1，SiC下1656/1546 cm^–1，FDM吻合峰位，但SiC实验谱出现额外峰，归因为蛋白-膜界面粘附致取向与构象变化；DNA在SiN下受SPhP掩盖1000–1300 cm^–1区间，SiC下清晰分辨PO₂^–对称拉伸1083 cm^–1与不对称拉伸1230 cm^–1及系列弱峰，模型复现主带但相对强度受DNA链相对近场垂直偏振取向影响。于“液相中α-突触核蛋白原纤维成像与光谱”小节，SiN膜下水相白光s₂图识别出贴膜蛋白聚集体亮区；点1（贴膜纤维膜50 nm）谱含酰胺I~1650 cm^–1与酰胺II 1565 cm^–1且水贡献少，点2（30 nm蛋白+30 nm水）水吸收主导但仍见酰胺II；FDM两种几何配置定性支持“信号反映蛋白/水相对贡献”结论，且β-折叠分量较α-螺旋弱于模型预期，系近场垂直偏振与纤维内各向异性偶极耦合差异所致。

讨论部分指出，膜厚30 nm的SiC仍给出清晰近场响应，证s-SNOM具亚表面灵敏度；实验与FDM定量偏差来源包括超薄膜介电函数提取误差、椭球探针有效长度近似、膜横向有限尺寸忽略、以及液相中分子非均匀簇集/取向/水化层等未纳入各向同性薄层假设的因素；SPhP在水损耗环境中行为难精确预测，需后续研究极化激元与分子振动耦合以增强灵敏度和波段。结论部分翻译如下：研究人员论证了s-SNOM用于原生类液相软物质无标记IR光谱的有效性，借助同步辐射宽带光在800–2000 cm^–1全段分辨BSA、DNA与α-突触核蛋白原纤维振动特征；SiN与SiC均可靠，SiC透明窗更宽利于DNA表征，平台亦可辨原纤维超分子结构；实验与FDM定性一致，微小定量差来自模型局限与膜边缘、分子取向等复杂配置；按近场作用体积估算检测灵敏度达BSA约1 zmol、DNA约10^–2 zmol，确认s-SNOM是水相生物软物质高灵敏纳米红外工具，为原生态蛋白动态与分子互作监测开创新路径。