双光子成像揭示电化学传感波形激活神经元的功率阈值

《Analytical Chemistry》：Two-Photon Imaging Reveals a Power Threshold of Neuronal Activation by Electrochemical Sensing Waveforms

　　

电化学传感能够实现高时间分辨率的神经化学动态测量，但传感波形对局部神经元兴奋性的影响尚未得到系统研究。研究人员将在体双光子Ca²⁺成像与通过植入皮层的碳纤维微电极施加传感波形相结合，在Thy1-GCaMP6s小鼠中确定传感波形如何影响神经元激活。用于多巴胺和血清素的标准快速扫描循环伏安法（FSCV）波形，以及方波伏安法（SWV）和安培法波形，在长达30 min内产生的Ca²⁺活性与无刺激对照无法区分，证实既定参数在生理学上是静默的。研究人员随后系统探索了常被提出用于提高灵敏度、增强特异性或检测新分析物的参数。将多巴胺FSCV波形的阳极开关电位升高至约2.1 V时开始产生强烈的神经元激活，超过约2.3 V后激活面积迅速饱和。阳极电位偏移比阴极偏移产生更强的激活，较慢的扫描速率和较高的扫描频率会增加激活。与传统微刺激不同，对传感波形的反应延迟52 ± 26 s，并在波形停止后持续存在，这与电化学反应副产物的扩散而非直接膜去极化一致。这些结果界定了一个参数空间，对应<0.5 mW的功率剂量，在该空间内FSCV不扰动神经活动。这建立了一个实用阈值，用于指导波形开发并帮助避免电化学传感过程中的意外神经元激活。

研究背景

实时监测活体脑内神经化学信号是理解神经环路调控行为、认知和疾病的基础。快速扫描循环伏安法（FSCV，一种通过快速电压扫描检测电活性物质的电化学技术）、方波伏安法（SWV，一种阶跃电位伏安技术）和安培法（恒定电位电流测量技术）是在体神经化学测量中最广泛采用的电化学手段。FSCV通过快速扫速和大电压摆幅获得高时间分辨率信号，同时也产生远超分析物法拉第电流的非法拉第电流，通常需要软件扣除。尽管研究人员不断优化波形参数以提高灵敏度、特异性或检测新分析物，但传感波形本身对局部神经兴奋性的影响尚未被系统评估。若波形诱发神经递质释放或网络激活，将严重混淆测量信号。既往膜片钳研究提示标准FSCV波形引起的膜电位变化约2.5 mV，远低于动作电位阈值，但不同参数组合的影响仍不清楚。因此需要系统界定不会扰动神经活动的波形参数空间。该研究发表在《Analytical Chemistry》。

研究概况

研究人员将Thy1-GCaMP6s转基因小鼠在体双光子Ca²⁺成像与植入后初级躯体感觉皮层的碳纤维微电极（CFME）相结合，在FSCV、SWV和安培法施加期间及之后记录神经元Ca²⁺活性。以像素z分数>3且超过5%帧数定义激活面积，并以无刺激对照均值+3倍标准差（974 μm²）作为强响应阈值。结果显示：标准多巴胺和血清素FSCV波形、SWV及安培法波形在30 min内均不产生可检测的神经元激活；当阳极开关电位升高至约2.1 V时出现强激活，超过约2.3 V后激活面积饱和；响应延迟约52 s并持续存在；功率剂量与激活面积高度相关，<0.5 mW的功率剂量可避免扰动神经活动。

关键技术方法

研究使用4只雄性Thy1-GCaMP6s转基因小鼠（C57BL/6J-Tg(Thy1-GCaMP6s)GP4.3Dkim/J，7–12周龄，Jackson Laboratories来源），共完成7次电极穿透。主要方法包括：在体双光子Ca²⁺成像监测皮层神经元活动；经CFME施加标准及参数修改波形；以z-score阈值法计算激活面积；以无刺激均值+3SD定义强响应；通过体外电流复测计算每扫功率与占空比乘积的功率剂量；并以颅内微刺激（ICMS，通过电极施加电流脉冲刺激皮层）对照比较时间动力学。

研究结果

标准神经化学传感波形不强烈激活神经组织：施加标准多巴胺和血清素FSCV波形、SWV及安培法波形后，神经元Ca²⁺激活面积与无刺激基线无显著差异（Kruskal-Wallis检验，p>0.1），延长至5、15、30 min仍无升高。

增大开关电位强烈激活神经组织：以标准多巴胺波形为基底逐步将阳极开关电位从1.3 V增至2.7 V，激活面积在2.1 V时超过基线3SD阈值，2.3 V后饱和；体外峰值电流和计算功率剂量呈非线性增加，且与激活面积高度相关（r=0.8419, p=1.9582×10^-8, n=28）。

高开关电位扫描后的神经活动存在延迟：强响应波形诱发的平均%dF/F峰值较波形起始延迟52±26 s（n=11），而ICMS脉冲串在刺激期间立即产生反应并数秒内消退。

高开关电位导致神经活动持续升高：2.5 V波形停止后2 min内Ca²⁺活性接近基线，但2.7 V波形停止后2 min内仍维持升高。

重复高开关电位扫描可诱导兴奋性抑制：经历强激活后，后续施加原先有效的2.7 V甚至更高至3.1 V的波形均不再产生反应，符合刺激诱导的神经兴奋性抑制（SIDNE），随后实验转移至新鲜皮层位点。

阳极开关电位比阴极开关电位产生更强激活：与阴极开关电位相比，阳极开关电位在更低电压下即触发强激活，表明激活不单纯取决于电压幅度，而与极性相关。

较慢扫描速率导致更强激活：标准1.3 V开关电位下，50–1000 V/s扫描速率均不激活；在1.9 V开关电位下，≤100 V/s的较慢扫描诱发强激活，而≥400 V/s不激活。

较高扫描频率导致更强激活：标准1.3 V下1–115 Hz均不激活；在1.9 V下，≥20 Hz可诱发强激活，低于标准10 Hz则无。

激活趋势推广至SWV传感：标准多巴胺SWV和亚甲基蓝适配体SWV均不激活；升高阳极最大电位至1.5–2.5 V之间触发强激活，升高阴极最大电位至-2.3至-2.5 V触发强激活，且同样存在停止后的持续激活。

讨论与结论

讨论指出，标准波形处于“生理静默”区间，支持FSCV现有参数不会因波形诱发神经活动而产生信号混淆的假设。然而，增大电位摆幅、降低扫速、提高频率都会增加单位时间暴露于极端电位的剂量，从而越过激活阈值。激活的延迟与持续特征不同于传统ICMS的直接膜去极化，更符合电极-组织界面上电化学反应副产物（如氯氧化产物、次氯酸及水氧化引起的酸化）的扩散性效应；酸化还可通过酸敏感离子通道1a（ASIC1a）升高神经元[Ca²⁺]。研究强调，以功率剂量<0.5 mW作为CFME的实用阈值，可指导波形开发时在灵敏度与生理影响间取得平衡。局限性包括仅使用CFME、仅评估皮层、未独立改变保持电位、未研究胶质和血管反应等。总体结论是：高阳极开关电位等参数极端操作会以延迟、持久的化学扩散方式激活神经组织，而标准传感波形在该测量尺度上不扰动神经活动。