《ACS Sensors》：Lighting Up Gut Dysbiosis: Red-Shifted Whole-Cell Bioluminescence Enables Functional Sensing of Bile Salt Hydrolase Activity in Human Feces
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胆盐水解酶（BSH）活性是肠道微生物群生态失调及胆汁酸（BA）代谢改变的一种新兴功能生物标志物，但其直接在人粪便中的定量仍具挑战性，因为粪便成分会强烈衰减光学信号。研究人员报道了一种红移全细胞生物发光（BL）生物测定法，用于人粪便中BSH的灵敏、准确定量传感。
胆盐水解酶（BSH）活性是肠道微生物群生态失调及胆汁酸（BA）代谢改变的一种新兴功能生物标志物，但其直接在人粪便中的定量仍具挑战性，因为粪便成分会强烈衰减光学信号。研究人员报道了一种红移全细胞生物发光（BL）生物测定法，用于人粪便中BSH的灵敏、准确定量传感。该平台将BSH可切割的笼状荧光素探针氨基荧光素-鹅脱氧胆酸（aLuc-CDCA）与表达工程化远红发射的Phrixothrix hirtus荧光素酶PxRE-R215K（λmax ≈ 640 nm）的Caco-2细胞偶联。在无细胞分析中，纯化的胆酰甘氨酸水解酶（CH）产生线性BL响应，检测限（LOD）为0.010 ± 0.002 U/mL；然而，粪便提取液分析受基质干扰严重。细胞内荧光素酶表达减轻了这些效应，且在稀释粪便悬液（1 mg/mL）中PxRE-R215K优于Amydetes vivianii绿光发射AmyLuc报告基因，LOD与定量限（LOQ）分别为0.02 ± 0.01和0.06 ± 0.04 U/mL。加标回收实验证实PxRE-R215K准确度高于AmyLuc（83.3?93.4% vs 66.7?87.5%），批间精密度改善（CV：14% vs 29.9%）。临床样本中，PxRE-R215K测定法检测到结直肠癌（CRC）组粪便BSH活性显著高于增生性息肉或腺瘤组。匹配血清样本的UHPLC-MS/MS胆汁酸（BA）谱分析佐证了该功能性读数，揭示CRC相关的总BA水平升高、次级/初级BA比值上升及非结合次级BA分数增加。该红移全细胞平台为粪便样本中微生物群相关BA代谢的功能监测提供了一种简便、可扩展且处理步骤最少的策略。
研究背景方面，人类肠道微生物群通过胆汁酸（BA）代谢与宿主生理密切互动，其中胆盐水解酶（BSH；EC 3.5.1.24）催化结合型BA水解为游离BA与氨基酸，是微生物BA代谢的起始限速步骤。BSH活性异常与炎症性肠病、代谢障碍及结直肠癌（CRC）等胃肠疾病相关，被视为菌群生态失调的功能生物标志物。然而现有方法（宏基因组测序、色谱BA谱、分离菌株体外酶活测定）无法直接定量完整生物样本中的功能性酶活，且荧光或短波长生物发光（BL）在复杂粪便基质中易受自荧光、散射及内源性发色团吸收干扰。因此，研究人员开展本研究，旨在构建一种在粪便复杂基质中抗干扰、可直接功能传感BSH活性的红移全细胞BL平台。
主要关键技术方法上，研究使用意大利博洛尼亚Sant’Orsola Malpighi医院ALMA0118单中心队列的54名男性受试者（增生性息肉7人、低至高级别异型增生腺瘤27人、CRC 20人）提供的39份粪便与53份血清样本；采用笼状探针氨基荧光素-鹅脱氧胆酸（aLuc-CDCA）被BSH水解释放6′-氨基-D-荧光素的设计；以Caco-2细胞为宿主转染表达巴西远红荧光素酶突变体PxRE-R215K（λmax≈640 nm）或绿光AmyLuc，比较红移与绿光报告基因在粪便基质中的信号保真度；以纯化艰难梭菌胆酰甘氨酸水解酶（CH）建标，通过加标回收与批间CV评估准确度与精密度；并以UHPLC-MS/MS平行定量血清与粪便BA谱进行跨平台验证。
研究结果部分，首先在设计原理中，研究人员将D-氨基荧光素通过酰胺键连接初级BA鹅脱氧胆酸（CDCA）形成aLuc-CDCA，该探针在生理液中稳定且仅被BSH选择性水解，无细胞系统中CH（0.06?0.30 U/mL）孵育60分钟获LOD 0.010±0.002 U/mL、LOQ 0.040±0.001 U/mL。在粪便无细胞检测小节，直接加入X-Shining荧光素酶时粪便上清（0.1?1 mg/mL）致光输出锐减，证实基质抑制酶活与光子传输。在全细胞BL检测比较小节，Caco-2细胞内表达荧光素酶隔离了基质抑制；PxRE-R215K（峰~640 nm）较AmyLuc（峰~520 nm）在1 mg/mL粪便中LOD 0.02±0.01 U/mL、LOQ 0.06±0.04 U/mL，AmyLuc为LOD 0.03±0.02、LOQ 0.08±0.03 U/mL。在分析性能小节，三供体粪便加标CH（0.12?1.20 U/mL）回收率PxRE-R215K为83.3?93.4%、AmyLuc为66.7?87.5%，批间CV分别为14%与29.9%；粪便上清在640 nm吸收低于520 nm，信号滞留实验证红移信号透射率更高。在临床样本应用小节，39份粪便（增生性息肉6、腺瘤22、CRC 11）经PxRE-R215K测定，CRC组BSH活性显著高于另两组（p<0.01及p<0.05）。在血清BA谱小节，UHPLC-MS/MS显示CRC组血清总BA、次级/初级BA比、非结合次级BA分数均升高，粪便BA因个体变异无组间显著差异。
讨论与结论翻译部分，研究人员指出红移全细胞BL配置通过波长选择降低了粪便光学衰减，细胞内酶表达屏蔽了基质蛋白酶与氧化还原干扰，使aLuc-CDCA探针可在1 mg/mL粪便悬液中直接功能量化BSH活性，LOD/LOQ优于既往无细胞或绿光体系；临床数据显示粪便BSH活性随结肠病变进展（增生性息肉→腺瘤→CRC）上升，且与血清BA去结合化、次级BA富集趋势一致，提示BSH功能读数是菌群-宿主BA轴失调的敏感指标。结论为：该红移全细胞生物发光平台耦合aLuc-CDCA与PxRE-R215K表达的Caco-2细胞，能够以最小样本处理在人粪便中实现BSH活性的灵敏、准确、可扩展功能传感，为胃肠道与代谢疾病中微生物群关联BA代谢监测提供了简易工具。
