《Langmuir》：Spectroscopic Insights into Nutrient-Controlled Biofilm Formation in Aureobasidium pullulans as a Basis for Engineered Living Materials
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真菌生物膜代表复杂的细胞外系统，在工程活材料（ELMs）中具有潜在应用价值，然而其在特定环境条件下的化学组成和结构变异性仍知之甚少。研究人员采用多模态光谱方法，包括FT-IR、FT-NIR和拉曼光谱，研究了在不同固体培养基上生长的出芽短梗霉菌株生物膜。富营养培
真菌生物膜代表复杂的细胞外系统，在工程活材料（ELMs）中具有潜在应用价值，然而其在特定环境条件下的化学组成和结构变异性仍知之甚少。研究人员采用多模态光谱方法，包括FT-IR、FT-NIR和拉曼光谱，研究了在不同固体培养基上生长的出芽短梗霉菌株生物膜。富营养培养基（PDA、SDA、YNB）产生的生物膜在不同菌株间具有大致保守的化学特征，而贫营养SNA培养基则诱导多糖、蛋白质和脂质组分以及基质组织和水合状态发生显著变化。主成分分析和多模块数据融合揭示，生长培养基是光谱变异的主要驱动因素，菌株身份起次要作用。与羟基（?OH）和脂肪族（?CH）基团对应的振动谱带被确定为区分的关键贡献者，反映了细胞外聚合物质（EPS）组成的变化。拉曼光谱提供了互补的分子信息，例如特征性蛋白质和多糖振动的存在，这有助于确认生物膜的生化组成，并支持了红外和近红外分析的结果。结果表明，控制营养组成和生长条件能够精确调节生物膜性质，包括水合状态、基质密度和功能性多糖含量。生物膜组成主要受营养组成影响，而非菌株的形态特征。这一点很重要，因为它表明活体涂层配方的研究可以集中于提供促进EPS产生和生物膜发育的营养物质，而不是选择具有特定形态的菌株。这些发现为理解环境控制下出芽短梗霉生物膜形成奠定了基础，并对未来工程活体涂层的发展具有重要意义，在工程活体涂层中，可以利用环境条件来影响生物膜的组成、结构及其功能特性。
论文解读：营养调控出芽短梗霉生物膜形成的光谱学研究及其对工程活材料的启示
一、研究背景与问题提出
出芽短梗霉（Aureobasidium pullulans）是一种具有重要生物技术价值的黑色酵母样真菌，具有多极端耐受性，分布广泛，能产生多种胞外酶和胞外多糖普鲁兰多糖（pullulan）。该真菌能够形成稳定、适应性强的生物膜，并分泌保护性多糖，因此被视为开发工程活材料（Engineered Living Materials, ELMs）的理想候选菌株，尤其适用于功能性表面保护涂层。然而，真菌生物膜的研究远少于细菌生物膜，而对于出芽短梗霉生物膜的详细化学组成和结构机制仍不清楚。现有的研究多集中于农业生物防治领域，对其生物膜在不同营养条件下的化学组成和结构变异缺乏系统认识。本研究旨在通过多模态光谱方法，探究三种不同形态的出芽短梗霉菌株在四种固体培养基上形成的生物膜的化学组成和结构差异，验证研究假设：在受控生长条件下，出芽短梗霉生物膜的化学组成和光谱特征主要由营养成分决定，而非菌株形态差异。这一研究对于开发可控的活性活体涂层系统具有重要的基础意义。
二、研究开展与主要结论
研究人员选取了三株形态特征不同的出芽短梗霉菌株（EXF-3645、EXF-3844、EXF-10507），分别在富营养培养基（PDA、SDA、YNB）和贫营养培养基（SNA）上培养14天，利用傅里叶变换近红外光谱（FT-NIR）、傅里叶变换红外光谱（FT-IR）和深紫外拉曼散射光谱（DUVR）对生物膜进行了多模态光谱分析。通过主成分分析（PCA）和多模块方差分析（ASCA）等化学计量学方法处理光谱数据，并结合数据融合技术，系统评估了培养基和菌株对生物膜化学组成的影响。
研究结果表明，在富营养条件下，不同菌株的生物膜化学特征高度相似；而在贫营养SNA培养基上，生物膜的多糖、蛋白质和脂质组分以及基质组织和含水量均发生显著变化。生长培养基是光谱变异的主要驱动因素，菌株身份仅起次要作用。具体而言，FT-NIR和FT-IR光谱显示，与?OH和?CH振动相关的谱带是区分不同生物膜状态的关键贡献者，反映了细胞外聚合物质（EPS）组成和水合状态的变化。拉曼光谱进一步提供了蛋白质和多糖振动等互补信息，确认了生物膜的生化组成。这些发现表明，通过控制营养成分和生长条件，可以精确调节生物膜的性质，包括水合程度、基质密度和功能性多糖含量。研究具有重要意义：它表明活体涂层配方的开发应当着重于提供促进EPS产生和生物膜生长的营养条件，而非仅仅筛选特定形态的菌株。
三、主要关键技术方法
本研究采用了三种互补的光谱技术：傅里叶变换近红外光谱（FT-NIR，覆盖4000–12000 cm
?1），直接测量固体培养基上的生物膜；傅里叶变换红外光谱（FT-IR，衰减全反射模式，4000–400 cm
?1），将生物膜样品直接置于金刚石晶体上测量；深紫外拉曼散射光谱（DUVR，激发波长248.6 nm），有效抑制荧光干扰，采集生物膜的拉曼信号。光谱数据经过标准正态变量（SNV）、一阶导数等预处理后，使用主成分分析（PCA）和多模块ASC模型（ANOVA同时成分分析）进行统计分析，并通过数据融合（合并NIR和IR数据，采用块方差缩放）来综合不同光谱模态的信息。菌株样本来源于斯洛文尼亚卢布尔雅那大学生物技术系Mycosmo基础设施中心文化保藏（Culture Collection Ex），具体包括冰川冰、干橄榄和大理石表面等不同栖息地。
四、结果分析
4.1 生物膜样品的生长
宏观观察显示，所有菌株在四种培养基上均可生长，但在SNA培养基上生物膜更薄、菌丝生长更弱；菌株EXF-10507主要呈酵母态，EXF-3645和EXF-3844更倾向于丝状态，尤其在SDA培养基上明显。这表明营养条件和菌株形态共同影响生物膜结构。
4.2 FT-NIR结果
对原始近红外光谱的初步观察显示，对照组样本紧密聚集，而SNA培养基上的生物膜分为三个亚组。经过SNV预处理后，出现两大主要分组，表明培养基的影响强于菌株。主成分分析沿PC1清晰区分了SNA培养基上的生物膜与对照组及其他组，PC2进一步将SNA生物膜与对照组分开。载荷图显示O–H官能团（可能来自水和糖类）有强烈贡献。采用一阶导数预处理后，SNA生物膜与其他组的分离更明显，约7000 cm
?1处的O–H和N–H泛音带以及5400 cm
?1处的O–H组合带是主要区分区域，表明水合状态和水分-基质相互作用是驱动光谱变异的关键因素。
4.3 FT-IR结果
FT-IR数据发现一个明显异常值（菌株EXF-10507在SNA上的第四个生物学重复）。去除异常值后进行PCA，PC1对PC2分数图显示SNA和YNB培养基上的生物膜与大多数其他组分离，SNA生物膜接近对照组。载荷向量突出了约500 cm
?1和1000 cm
?1的糖类相关峰区域，表明这些区域对区分生物膜状态具有信息价值。
4.4 多模块数据融合
将一阶导数NIR数据与SNV处理的IR数据合并并进行块方差缩放后，简单数据融合结果基本强化了单个分析的结论：培养基的影响仍然是主导因素，但原先在PC2上的效应转移到了PC3。多模块ASCA模型显示，因子1（培养基）和因子2（菌株）均高度显著（p = 0.001），且两因子组合时样品组间保持强烈分离。值得注意的是，NIR中仅1个主成分与培养基和菌株变异相关，而IR需要2个主成分，说明NIR提供较整体的水合和基质信息，IR则提供更详细的生化组分信息。
4.5 深紫外拉曼光谱结果
DUVR拉曼光谱中，对照培养基具有特征性振动峰，如SNA中1060 cm
?1（可能来自硝酸钾）和1650 cm
?1；YNB中1000 cm
?1（可能来自硫酸铵）。但经过多种预处理和PCA分析，样品组间未观察到清晰的聚类分离。因此，拉曼结果主要用于确认生物膜中存在特征性蛋白质和多糖振动模式，作为支持和补充信息，而非提供组间差异的决定性证据。
五、讨论与结论总结
讨论部分指出，FT-IR和FT-NIR光谱数据表明，尽管菌株形态不同，但在富营养条件下生物膜化学组成保守；而贫营养SNA培养基引起了显著的光谱偏移，这既反映化学组成变化，也可能反映生物膜物理组织（厚度、水合、密度）的变化。?OH和?CH谱带的强贡献表明多功能团来自胞外多糖（如普鲁兰多糖）和脂质/蛋白质。ASCA模型证实培养基是主要驱动因素。这些发现对工程活体涂层具有直接意义：通过控制营养组成可精确调节生物膜性质和EPS含量，涂层配方策略应优先考虑促进EPS产生的营养供给，而非仅筛选特定形态菌株。研究也存在局限，未直接定量测量各组分，采用简化琼脂系统不能完全模拟真实建筑环境，但为未来复杂条件下的研究提供了基线框架。
结论部分明确：出芽短梗霉生物膜的化学组成和结构组织强烈受生长培养基影响，菌株身份在富营养条件下起次要作用。FT-IR和FT-NIR揭示了富营养条件下生物膜基质跨菌株保守，而贫营养条件诱导显著变化。拉曼光谱提供补充生化信息。多模态分析（PCA、数据融合、多模块ASCA）确认培养基是光谱变异的主要驱动因素，?OH和?CH振动区域对区分生物膜状态有意义。该研究提供了受控条件下出芽短梗霉生物膜的基础光谱和化学计量学表征，为未来开发工程活体涂层奠定了基础。
