使用涵盖60种独特标志物的两个互补光谱流式细胞术组合对人外周血单个核细胞进行综合免疫表型分析

《Frontiers in Immunology》：Comprehensive immune profiling of human peripheral blood mononuclear cells using two complementary spectral flow cytometry panels encompassing 60 unique markers

　　

摘要
综合免疫表型分析对于旨在识别诊断和预后生物标志物的免疫监测研究至关重要。外周血单个核细胞（PMBCs）在疾病过程中会发生表型和功能变化，使其在横断面和纵向免疫监测研究中成为表征免疫细胞组成的重要工具。研究人员开发了一种基于两个互补组合、涵盖60种独特标志物的综合免疫分型方法，用于表征人外周血单个核细胞（PBMCs）中的B细胞、T细胞、固有淋巴样细胞（ILCs）、γδ T细胞、黏膜相关恒定T（MAIT）细胞、自然杀伤（NK）细胞、单核细胞、树突状细胞（DCs）及其多个亚群，包括其功能状态。将标志物分配至两个互补组合中，可以纳入比当前最先进光谱流式细胞仪在单一组合中所允许的更多标志物，从而能够在更深度的分析水平上对广泛的免疫细胞亚群进行免疫表型分析。这包括稀有亚群和需要多种标志物组合才能解析的亚群，并同时具备评估分化、活化和耗竭状态的能力。该方法能够解析超过50种不同的细胞群体，并详细探索这些亚群的分化、活化和耗竭状态，这一点已在来自健康供者、胶质母细胞瘤、炎症性肠病和COVID-19患者的PBMC样本中得到验证。该方案支持手动和无人监督的数据分析方法，适用于需要标准化、可重复的多批次工作流程的大规模免疫监测研究。

**基于双光谱流式细胞术组合的PBMC综合免疫表型分析：方法开发与多疾病应用**

**研究背景与意义**

外周血单个核细胞（PBMCs）作为免疫系统的“哨兵”，持续在血液与组织间循环，其表型和功能状态的动态变化能够敏感地反映机体在感染、肿瘤及自身免疫性疾病等病理状态下的免疫应答特征。因此，对PBMCs进行深度免疫表型分析是识别细胞性诊断和预后生物标志物的核心策略，对于疾病机制研究和免疫治疗疗效评估具有重要价值。然而，传统流式细胞术受限于荧光染料光谱重叠，单一抗体组合通常只能包含20-30个标志物，难以全面解析免疫细胞亚群的复杂性和功能状态。尽管光谱流式细胞术通过测量荧光染料的完整发射光谱，显著提高了多色 panels 的容量，但此前报道的最大组合也仅包含50个标志物，仍不足以在一次实验中覆盖T细胞、B细胞、NK细胞、固有淋巴样细胞（ILCs）、γδ T细胞、MAIT细胞、单核细胞和树突状细胞（DCs）及其精细亚群。此外，现有方法往往侧重于谱系分型，而未能充分整合分化、活化和耗竭状态等功能标志物。针对这一技术瓶颈，研究人员旨在开发一种基于Cytek Aurora 5激光光谱流式细胞仪的创新策略，通过将60种独特标志物分配至两个互补的组合中，实现对PBMCs中超过50种免疫细胞群体的深度解析，同时评估其分化、活化及耗竭状态，为大规模免疫监测研究提供标准化、可重复的技术方案。

**研究内容与技术方法**

研究人员设计并优化了两个互补的光谱流式细胞术组合（Panel 1和Panel 2），共包含60种独特标志物。Panel 1聚焦于T细胞谱系，涵盖CD3、TCRγδ、TCRVδ2、CD4、CD8、CD45RA、CCR7、CD27、CD28、CD95等功能标志物，以及CD56、CD16、CD127、CRTH2、cKIT等用于NK细胞和ILCs分型的标志物，并引入了CD69、CD39、TIGIT、PD-1、CTLA-4、TIM-3、LAG3、Ki67等活化、耗竭和增殖标志物。Panel 2则侧重B细胞、单核细胞和DCs，包含CD19、CD20、IgD、IgM、IgG、CD24、CD38、CD27等B细胞亚群标志物，以及CD11c、CD1c、CD141、CD303、CD14、CD16等髓系细胞分型标志物，并加入CD40、CD73、FcRL4、FcRL5、CD80、CD86、CD169、CD163等功能相关分子。方法开发过程遵循严格的panel设计原则：依据抗原表达密度进行荧光素分配，利用Cytek Full Spectrum viewer评估谱间相似性，计算Spillover Spread Matrix以最小化光谱溢出，并通过多轮迭代测试优化抗体浓度和染色顺序。方案的关键技术环节包括：基于密度梯度离心法从健康供者（n=8）及胶质母细胞瘤（GBM，n=7）、慢性炎症（CI，n=6）和COVID-19（n=6）患者样本中分离PBMCs，冻存后复苏（含活率评估），采用eBioscience Foxp3/Transcription Factor Staining Buffer Set进行固定/破膜，完成表面和胞内染色。数据采集在Cytek Aurora 5激光光谱流式细胞仪上进行，并使用SpectroFlo软件进行光谱解混。数据预处理采用PeacoQC自动质量控制算法，结合手动清洗去除碎片、死细胞和CD45?事件。为校正多批次实验间的系统漂移，以同一健康供者PBMC样本为参考，采用CytoNorm算法和FlowSOM聚类进行批次校正。数据分析综合应用手动门控策略和无人监督分析方法（UMAP降维、Phenograph聚类、opt-SNE），并通过7位流式细胞术专家对健康供者样本进行可重复性评估（计算变异系数CV%）。

**研究结果**

**数据预处理与质量控制**：通过PeacoQC算法自动清洗数据，并结合手动门控排除碎片、粘连体、死细胞和CD45?细胞，确保后续分析的准确性。

**手动门控策略**：研究人员建立了全面的手动门控策略，在Panel 1中成功区分早期（CD56^highCD16?）、成熟（CD56?CD16?）和终末（CD56?CD16?）NK细胞亚群，以及基于CD127、CRTH2和cKIT表达将ILCs分为ILC1、ILC2和ILC3三个亚群。在T细胞谱系中，利用TCRγδ和TCRVδ2区分γδ1和γδ2 T细胞，通过TCRVα24J18识别iNKT细胞，并基于TCRVα7.2、CD8和CD161的组合将MAIT细胞细分为多个亚群。进一步对CD4?和CD8? T细胞，依据CD45RA、CCR7、CD27、CD28和CD95的表达，成功识别出Na?ve、T_SCM、T_CM、T_EMRA及四种不同分化阶段的效应记忆（EM）亚群，并鉴定了调节性T细胞（Treg）和滤泡辅助T细胞（T_FH）。在Panel 2中，通过CD19和CD20门控B细胞，并结合IgD、IgM、IgG、CD24、CD27、CD38和CD10等标志物，成功解析了过渡性B细胞、边缘区B细胞、初始B细胞、调节性B细胞、浆母细胞、记忆B细胞及其IgM?、IgG?和IgM?IgG?亚群。从髓系细胞中识别出cDC1、cDC2、pDC三种DC亚群，经典、中间和非经典单核细胞，以及早期髓源性抑制细胞（eMDSCs）。通过7位专家的重复门控评估，大多数细胞群的CV%较低，表明手动策略具有高度的可重复性，但ILCs等需要复杂层级门控的稀有亚群以及终末NK细胞等表型渐变群体CV%相对较高，提示这些群体需要更精细的门控策略。

**无人监督分析**：为了充分挖掘高维数据潜能，研究人员应用UMAP降维和Phenograph聚类，实现了无偏的免疫细胞群解析，成功注释了超过50种细胞亚群。该分析在NK细胞、γδ T细胞和MAIT细胞中发现更为精细的异质性，这些群体可能包含生物学功能不同的新亚群。然而，在CD4?和CD8? T细胞中，无人监督聚类对效应记忆亚型的解析度不如手动门控。为弥补这一局限，研究人员针对T细胞、非经典T细胞和B细胞三个谱系数据，应用opt-SNE算法进行二次降维分析，有效恢复了亚群分辨率，与手动门控结果高度一致，验证了该策略在谱系特异性精细分型中的价值。

**多疾病样本的应用展示**：将开发的方案应用于健康供者及GBM、CI和COVID-19患者的PBMC样本，通过对比分析发现不同疾病状态下免疫细胞组成存在显著差异。例如，GBM患者中IgG?IgM?记忆B细胞比例发生变化，COVID-19患者的单核细胞亚群分布具有特征性改变。这些结果初步展示了该方案在识别疾病相关免疫特征方面的应用潜力。

**讨论与结论**

本研究成功建立了基于两个互补光谱流式细胞术组合的综合免疫分型方法，该方法突破了传统单一大组合的局限，将总标志物数量扩展至60种，实现了超过50种免疫细胞亚群的深度解析，同时覆盖分化、活化和耗竭等多维度功能状态评估。该方案具有多重优势：其一，通过双组合设计有效平衡了标志物数量与光谱解析度，尤其适合需要复杂标志物组合才能识别的稀有细胞亚群（如ILCs）的研究；其二，结合手动门控和无人监督分析，兼顾了假设驱动验证和发现性研究的双重需求；其三，CytoNorm批次校正有效保障了多批次、大规模研究的可重复性。讨论部分指出，该方案的主要局限在于染色流程耗时较长和仅适用于PBMCs，未来可考虑根据样本类型优化标志物组合。此外，该方案尚未在同类市售仪器间验证跨平台一致性，建议在不同平台上使用时进行必要的优化和重新校准。总之，研究人员设计的这一综合免疫分型策略为免疫监测研究提供了强大的技术支撑，可用于细胞性诊断和预后生物标志物的识别，并为深入理解肿瘤、炎症及感染性疾病中的免疫应答机制及免疫治疗疗效评估提供可靠的技术工具。
研究结论：研究人员开发并验证了一种基于两个互补光谱流式细胞术组合的综合免疫分型方法，涵盖60种独特标志物，能够实现对人PBMCs中超过50种免疫细胞群体的同步解析，并评估其分化、活化及耗竭状态。该方法通过严格的panel设计优化、标准化操作流程和有效的批次校正，在多个健康供者和不同疾病（包括胶质母细胞瘤、慢性炎症和COVID-19）样本中展示了良好的分辨率和可重复性。该策略为大规模免疫监测研究提供了有力工具，有助于疾病相关免疫生物标志物的识别和免疫治疗反应的评估。