仿生呼吸型气道暴露系统用于吸入暴露研究

《Frontiers in Bioengineering and Biotechnology》：Bionic breathing-type airway exposure system for inhalation exposure studies

　　

摘要：为弥补基于动物和静态体外模型在解剖保真度和呼吸动力学方面的局限性，研究人员开发了一种个性化仿生气道暴露系统，作为具有生理相关性的替代方案。该平台整合了解剖学精确的人体气道复制品（从气管至G3级支气管，基于胸部CT和3D打印重建）、毫秒级同步动态呼吸控制（含五种波形及经口/经鼻/口鼻联合吸入途径）、分支级沉积分析、独立的经口与经鼻回路、CO₂交换以及多区域暴露接口。通过可编程逻辑控制，该系统可模拟从正常到病理状态（包括整合吸烟模式）的呼吸过程，同时实现气体交换和位点特异性暴露测试。验证结果表明，该系统重现了右侧优势气流分布（右主支气管51.6% ± 0.1%对左主支气管48.4% ± 0.1%）以及不同吸入模式下的颗粒物沉积差异（大循环78.0% ± 1.6%对小循环61.7% ± 1.3%）。BEAS-2B细胞表现出剂量依赖性细胞毒性和细胞因子释放，而hiPSC来源的肺模型显示出与人类气道病理一致的选择性炎症反应。该平台提供了一种模拟人体呼吸生理的体外模型，支持吸入毒理学和药物筛选，同时减少对动物试验的依赖。

论文解读：仿生呼吸型气道暴露系统——面向吸入暴露研究的体外模型新范式

一、研究背景与问题

呼吸系统是人体与外界环境进行气体交换的关键界面，也是环境污染物进入体循环的主要门户。流行病学数据显示，慢性呼吸系统疾病每年导致约390万人死亡，给社会带来沉重负担。吸入毒理学研究需要能够准确模拟人体呼吸暴露的实验模型，以科学评估外源性吸入物对健康的风险。当前主流研究手段包括啮齿动物体内实验和体外替代试验，然而动物模型存在显著的种属差异，包括呼吸模式、气道解剖结构、沉积特征及清除代谢机制等方面，这些差异严重制约了动物数据向人体外推的可靠性。体外模型虽借助气液界面（ALI）培养、类器官和器官芯片等技术取得了进展，但暴露装置的发展明显滞后。广泛使用的VITROCELL? Cloud系列暴露平台采用“云沉降”机制，将气溶胶直接导入空腔依靠重力沉降，其物理设计高度简化，存在三大根本缺陷：缺乏解剖结构，无法重现气道几何决定的湍流和惯性撞击所致的区域性沉积；缺乏呼吸动力学，无法模拟潮气量、呼吸频率和吸呼比对沉积效率的影响；暴露途径单一，无法区分经口与经鼻这两种解剖和生理上截然不同的暴露路径。这种“高仿生细胞模型”与“高度简化物理暴露模式”之间的脱节，已成为体外数据向真实人体风险评估转化的关键瓶颈。尽管已有多种仿生暴露系统被报道，但尚无单一平台能同时整合解剖精确的气道几何、毫秒级同步的口/鼻呼吸控制和分支级沉积分析。为此，研究人员开发了一种仿生呼吸型气道暴露系统。

二、研究目标与系统设计

该研究旨在构建一个兼具解剖保真度和功能完整性的体外吸入暴露平台。系统整合了从气管到第三级支气管（G0-G3）的3D打印解剖气道模型，采用可编程逻辑控制器（PLC）实现毫秒级（≤0.1 s）呼吸周期与气溶胶投递的同步控制，并配备独立的口腔和鼻腔吸入回路、CO₂交换模块以及多区域暴露接口。系统支持五种呼吸波形（正弦波、方波、三角波、钟形波和呼吸波）的自由编程，潮气量可在0-1000 mL范围内调节，呼吸频率、吸呼时间、屏气时间及CO₂浓度均可独立设定，从而模拟从正常生理到病理状态（包括慢性阻塞性肺疾病、机械通气和高碳酸血症）的多种呼吸模式。

三、主要技术方法

研究人员采用以下关键技术方法：（1）基于健康成年男性胸部CT图像，利用Mimics软件进行三维重建，并通过立体光刻（SLA）3D打印技术制备透明光敏树脂气道模型（层厚100 μm，垂直分辨率25 μm）；（2）利用PLC和伺服电机驱动注射器，实现精确的呼吸波形生成和潮气量控制；（3）通过电磁阀阵列实现口/鼻吸入途径的独立或联合控制；（4）采用流量传感器和CO₂传感器进行实时监测和闭环反馈调节；（5）以标准研究用卷烟为测试气溶胶，采用ISO 3308:2012标准抽吸参数（35 mL/2 s抽吸容量和持续时间）进行烟雾暴露；（6）在支气管分支末端连接细胞暴露单元，结合流场分布数据进行区域剂量归一化；(7) 使用BEAS-2B细胞系和hiPSC来源的肺模型进行生物学验证。hiPSC分化采用实验室建立的27天分化方案，将细胞诱导为包含基底细胞、纤毛细胞、Club细胞、杯状细胞、I型/II型肺泡上皮细胞、神经内分泌细胞、祖细胞、间充质细胞、内皮细胞和巨噬样细胞的多细胞肺模型。

四、研究结果

（一）气管支气管树模型的构建与气流分布分析

基于CT数据构建的3D打印气道模型呈现典型的非对称分支结构：右侧支气管为1-3-10构型，左侧为1-2-9构型。分支内径测量值与参考解剖数据高度一致。在500 mL潮气量条件下，气流分布呈现显著的“右侧优势”现象，右主支气管流量为51.6% ± 0.1%，显著高于左主支气管的48.4% ± 0.1%（p < 0.05），且各支气管代之间保持良好的流量守恒。这一结果与计算流体力学（CFD）模拟一致，而传统空腔暴露系统无法重现这一因解剖不对称导致的气流分布差异。该系统通过多接口设计，可将细胞暴露单元连接至口腔、鼻腔及不同级别支气管分支（G0-G3），实现同一呼吸周期内不同吸入途径和不同气道区域的沉积剂量解析。

（二）系统性能验证：动态呼吸模拟与吸烟模式再现

系统在呼吸时序控制方面实现毫秒级精度，设定的吸呼时间（1.5s、2s、3s）误差≤0.40%；屏气时间（1s、2s、3s）控制误差≤±0.99%。流量控制方面，设定潮气量（300-830 mL）的实测偏差≤±0.12%，口吸烟雾量（35 mL、55 mL）控制偏差≤±0.88%，鼻吸空气量（445 mL、465 mL）偏差≤±0.07%。CO₂注射量偏差≤±0.81%，生成浓度与设定值完全一致。系统成功再现了经典小循环吸烟伴呼吸模式、经典大循环吸烟伴呼吸模式以及个性化吸烟伴呼吸模式。在模式复现验证中，系统以“1次吸烟+3次潮气呼吸”为周期循环运行，小循环模式在2 s吸入窗口内同步完成口吸35 mL烟雾和鼻吸465 mL空气，合成为500 mL潮气量；大循环模式在吸入后增加了气体交换阶段，注入10 mL 16% CO₂，模拟肺泡气体交换；个性化模式则允许对每个阶段的波形、持续时间和屏气时间进行独立编程。定量分析显示，大循环模式下烟雾平均沉积率为78.0% ± 1.6%，显著高于小循环模式的61.7% ± 1.3%（p < 0.05），与人体研究报道的趋势一致。此外，系统在模拟呼吸过程中维持暴露室内O₂浓度在16-21%生理范围内，CO₂稳态浓度稳定在设定值（如3.57% ± 0.1%），保障了细胞微环境的稳定。

（三）基于BEAS-2B细胞模型的平台可行性验证

将系统与BEAS-2B细胞整合后，成功模拟了生理性气血交换微环境：吸气相细胞暴露于含21% O₂/0.04% CO₂的气体，呼气相暴露于含3.57% ± 0.01% CO₂/16.49% ± 0.05% O₂的气体，但细胞周围液体环境pH值保持稳定（7.49 ± 0.16），细胞活力不受影响。剂量-反应实验显示，烟雾暴露剂量从3.45 puff增加至6.90 puff时，BEAS-2B细胞活力显著降低25.0%（p < 0.05），IL-8分泌从16.37 ± 0.53 pg/mL增至32.10 ± 3.62 pg/mL，IL-6分泌从5.51 ± 1.39 pg/mL增至11.51 ± 1.76 pg/mL（p < 0.05）。值得注意的是，相比传统静态暴露系统（在0.96和4.56 puff剂量下即产生效应），该系统需要更高的名义暴露剂量（3.45和6.90 puff）才能引发同等水平的细胞毒性。这并非设计缺陷，而是“主动吸入”过程导致部分颗粒沉积于上气道或随呼气排出，更真实地反映了体内暴露的生理实际。

（四）基于hiPSC来源肺模型的烟雾暴露评估

为克服BEAS-2B单层细胞缺乏纤毛和黏液层等防御机制的局限，研究人员引入了hiPSC来源的多细胞肺模型。该模型通过连续表达ZO-1形成完整紧密连接环，并表达KRT5（基底细胞）、AcTUB（纤毛细胞）、CC10（Club细胞）、MUC5AC（杯状细胞）、PDPN（I型肺泡细胞）、SFTPB/SFTPC（II型肺泡细胞）、CHGA（神经内分泌细胞）、SOX2/SOX9（祖细胞）、PDGFR-α（间充质细胞）、CD31（内皮细胞）和CD68（巨噬样细胞）等多种细胞类型标记物。在“大循环”吸烟模式暴露后，该模型表现出上皮屏障损伤（TEER值降至基线的85.27%，p < 0.05，ZO-1免疫荧光信号破坏弥散）和细胞内活性氧（ROS）水平显著升高。尽管该模型接受的表面积极标准化剂量（3.48 puffs/cm2）高于诱导BEAS-2B毒性的剂量（0.74和1.48 puffs/cm2），但细胞活力并未显著下降，这可能归因于模型内祖细胞群体（基底细胞和Club细胞）的抗凋亡修复能力、多细胞间旁分泌信号（如巨噬样细胞释放抗炎因子）以及完整紧密连接提供的物理屏障。炎症反应方面，hiPSC模型仅表现出IL-8的显著升高（p < 0.05），而IL-6无显著变化，呈现选择性的中性粒细胞趋化因子响应，与BEAS-2B细胞中IL-6和IL-8同步上调的模式截然不同。这种“屏障损伤+氧化应激+选择性炎症（IL-8）”的调控模式更贴近吸烟者气道“中性粒细胞炎症伴上皮屏障功能障碍”的病理特征。

五、讨论与结论

讨论部分指出，该系统与现有仿生暴露平台相比具有差异化优势：相比VITROCELL? Cloud等被动沉降系统，该系统实现了主动吸入过程模拟，能区分“吸入后沉积”与“单纯沉降”；相比Lizal等的CT气道模型，该系统整合了动态呼吸控制和细胞暴露接口；相比Steiner等的InHALES系统，该系统采用患者特异性CT重建解剖结构而非理想化Weibel模型，并支持口/鼻吸入途径的独立编程；相比Sarles等的BAES系统，该系统具备解剖精确的分支几何和复杂细胞模型整合能力；相比Benam等的仿生吸烟机器人，该系统提供全尺寸解剖气道树和独立口鼻控制，而不仅仅是微通道。研究还提出了气道分支水平沉积差异的潜在应用——右主支气管更宽、更短、更垂直的解剖特征导致右肺接受更高比例的颗粒物，流行病学数据也支持右侧肺癌发生率更高（60%对40%）。该平台为验证区域沉积异质性提供了实验途径。研究结论部分明确指出：本研究成功构建了整合解剖精确气道模型、毫秒级同步动态呼吸控制、独立口鼻暴露接口和生理气体交换模块的仿生呼吸型气道暴露系统，系统克服了现有体外系统在解剖结构、呼吸动力学和暴露途径单一性方面的固有局限。该系统精确重现了不对称支气管树内的气流分布特征，模拟了吸烟特异性的小循环和大循环模式及其对颗粒沉积效率的决定性影响，在体外模型中实现了“气溶胶如何被吸入、沉积何处以及沉积多少”全过程的精确模拟。通过与BEAS-2B细胞和hiPSC来源肺模型的整合，该系统揭示了动态呼吸过程对名义暴露剂量的显著调节作用，以及在近似生理微环境中烟雾暴露诱导的“上皮屏障损伤-氧化应激激活-选择性炎症”精细调控模式，为吸入毒理学研究和复杂混合物（如香烟烟雾和空气污染物）的健康风险评估提供了高度仿生的实验工具，在环境健康风险评估和个性化吸入治疗开发中展现出广阔的应用前景。