软奶酪与生宠物食品中单核细胞增生李斯特菌快速环介导等温扩增检测方法的开发与验证

《Frontiers in Microbiology》：Development and validation of a rapid Listeria monocytogenes loop-mediated isothermal amplification assay in soft cheese and raw pet food

　　

引言：对人和动物食品中的单核细胞增生李斯特菌（Listeria monocytogenes）进行快速筛查，对于提高实验室效率并保障食品供应安全至关重要。方法：研究人员开发了一种靶向单核细胞增生李斯特菌hlyA基因（李斯特菌溶血素O，listeriolysin O）的环介导等温扩增（loop-mediated isothermal amplification，LAMP）检测方法，并在代表性人类食品（软奶酪）和动物食品（生宠物食品）基质中进行了单实验室验证。本研究遵循美国食品药品监督管理局（U.S. Food and Drug Administration，FDA）的微生物学方法验证指南，并以FDA的《细菌学分析手册》（Bacteriological Analytical Manual，BAM）方法作为参考方法。结果：通过分析由50株单核细胞增生李斯特菌、20株非单核细胞增生李斯特菌属菌株和31株非李斯特菌属菌株组成的包含性及排他性菌株 panel，该检测方法获得了准确结果（阳性和阴性）；当使用单核细胞增生李斯特菌美国典型培养物保藏中心（American Type Culture Collection，ATCC）19115菌株时，检测限为每反应100个细胞。软奶酪和生宠物食品的验证均获得满意结果，配对研究中相对检出水平（relative levels of detection，RLODs）均落在可接受限度（1.5）之内。这表明，在两种基质中，对48小时增菌液进行LAMP分析的灵敏度不亚于BAM培养法，能够检测低水平单核细胞增生李斯特菌污染，且获得可靠筛查结果的时间至少提前3天。讨论：本研究证明了这种快速、可靠的LAMP检测方法在软奶酪和生宠物食品中常规筛查单核细胞增生李斯特菌的潜力，并且经过进一步验证，该方法还可拓展至更多人类和动物食品，以确保产品安全并保护公众健康。

**研究背景与目标**

单核细胞增生李斯特菌（Listeria monocytogenes）是一种革兰氏阳性、兼性厌氧食源性病原体，在全球范围内具有显著的公共卫生意义，其在高危人群（孕妇、老年人及免疫功能低下者）中的病死率高达20%–30%。在美国，该菌每年估计导致约1,250例疾病和172例死亡，住院率高达93%。近年来，与软奶酪、熟食肉类、预制餐、烟熏鱼和新鲜农产品相关的多州李斯特菌病暴发屡有发生；同时，随着宠物主人喂食生肉饮食的趋势上升，生宠物食品因单核细胞增生李斯特菌污染而被召回的事件也不断增加，凸显了该病原体在人类和动物食品中的广泛安全风险。

目前，培养法仍是食品中单核细胞增生李斯特菌检测的金标准，如FDA的《细菌学分析手册》（Bacteriological Analytical Manual，BAM）第10章、美国农业部（USDA）的《微生物学实验室指南》（MLG）方法8以及国际标准化组织（ISO）11290-1/2标准。然而，这些方法涉及选择性增菌、选择性平板划线及生化/血清学/质谱确认，整个过程可能需要2周或更长时间。虽然已有多种商品化分子筛查试剂盒（如实时荧光定量PCR和环介导等温扩增，LAMP）获得AOAC国际官方分析方法（OMA）认证，但经过多种人类和动物食品基质严格验证、且与FDA BAM工作流程兼容的开源分子检测方法仍然稀缺。因此，本研究旨在开发一种快速、特异、灵敏的单核细胞增生李斯特菌LAMP检测方法，并以FDA BAM培养法为参考，在代表性人类食品（软奶酪）和动物食品（生宠物食品）基质中进行单实验室验证（single-laboratory validation，SLV）。

**主要技术方法**

本研究选用了靶基因hlyA（李斯特菌溶血素O编码基因，1,590 bp，提取自单核细胞增生李斯特菌EGD-e染色体，GenBank登录号AL591824），使用PrimerExplorer V5软件设计了一套包含五个引物（F3、B3、FIP、BIP和环引物LB）的LAMP引物组，识别靶序列的七个区域。反应采用OptiGene公司的GspSSD2.0等温预混液（ISO-004）和便携式实时荧光仪（Genie II）进行，扩增程序为65 °C 30分钟，随后以0.05 °C/秒的速率从98 °C退火至80 °C。研究比较了四种引物混合比例（OptiGene Standard、OptiGene High、NEB WarmStart和自研Prototype），并测试了60 °C–67 °C的反应温度梯度，最终确定以Prototype引物混合（0.1 μM F3/B3，1.8 μM FIP/BIP，1 μM LB）和65 °C作为最优反应条件。

特异性测试采用包含性panel（50株单核细胞增生李斯特菌，涵盖不同谱系I、II、III和血清型1/2a、1/2b、1/2c、3a、3b、3c、4a、4b、4c等）和排他性panel（20株非单核细胞增生李斯特菌属菌株，涵盖5个种；31株非李斯特菌属菌株，涵盖13个属），菌株来源包括FDA人类食品计划（HFP）菌株库和ATCC。灵敏度（检出限，LOD）通过单核细胞增生李斯特菌ATCC 19115的10倍梯度稀释进行测定。食品基质验证方面，软奶酪（queso fresco类型）购自当地杂货店，生宠物食品（鸡肉基冷冻生狗粮）由第三方实验室（Q Laboratories）按FDA要求制备；两种基质均按照FDA微生物学方法验证指南进行配对研究设计，以BAM培养法为参考。软奶酪验证采用单核细胞增生李斯特菌CFSAN011016（血清型1/2b，分离自新鲜奶酪凝乳），生宠物食品验证采用ATCC 19111（血清型1/2a，分离自家禽）。增菌液在48小时时分别采用Qiagen DNeasy Blood & Tissue Kit和/或PrepMan Ultra Sample Preparation Reagent提取DNA后进行LAMP检测，并与BAM培养法结果进行比较，采用相对检出水平（RLOD）作为统计指标，可接受限度设为1.5。样本队列来源包括：50株单核细胞增生李斯特菌和51株非靶标菌株来自FDA/HFP菌株库及ATCC，软奶酪和生宠物食品分别购自当地商店和在线商店。

**研究结果**

**LAMP优化。** 四种引物混合在检测1,000个细胞/反应模板时均能一致检出（3次重复），其中Prototype引物混合的检出时间最快（12.0 ± 0.7分钟）。在100个细胞/反应水平下，仅Prototype引物混合在3次重复中全部检出（18.6 ± 9.4分钟），而其他三种混合的检出率较低。温度优化实验表明，在低于63 °C的反应温度下，虽然灵敏度有所提高（可检测至1个细胞/反应），但排他性降低，出现非特异性扩增信号；而65 °C运行条件下，全部51株排他性菌株均无扩增信号，因此选择65 °C作为反应温度。

**测定特异性。** 在初始包含性测试（约100–10²个细胞/反应）中，LAMP检出50株中的43株（检出率86%）。对7株未检出的菌株（涵盖血清型1/2c、3c、4a、4b和4c等）在更高浓度（约10¹–10³个细胞/反应）下进行系列稀释测试后，所有7株均被检出，表明包含性达到100%。50株包含性菌株的检出时间（Tp）范围为6.1–25.4分钟（平均11.3 ± 3.9分钟），退火温度（Ta）范围为82.0 °C–84.9 °C（平均82.6 ± 0.4 °C）。统计分析发现，血清型1/2a菌株的Tp（8.5 ± 1.4分钟）显著快于4b菌株（12.1 ± 3.2分钟，p = 0.0017），谱系II菌株（8.5 ± 1.5分钟）显著快于谱系I菌株（11.9 ± 2.7分钟，p = 0.0001）；Ta在不同血清型和谱系间也存在显著差异。排他性测试中，全部51株非靶标菌株（浓度约10⁶个细胞/反应）均获得阴性结果，排他性为100%。

**测定灵敏度。** 以单核细胞增生李斯特菌ATCC 19115进行3次重复测试，LAMP可稳定检测至100个细胞/反应水平，Tp范围为7.3 ± 0.03分钟（10⁶个细胞/反应）至14.9 ± 1.9分钟（100个细胞/反应），Ta平均为82.7 ± 0.2 °C。基于三次重复生成的标准曲线在10⁶–10²个细胞/反应范围内表现出良好的线性关系（R2 = 0.919）。7株初始包含性检测未通过的菌株的LOD在约10¹个细胞/反应（3株）至约10³个细胞/反应（2株）之间。

**软奶酪验证。** 软奶酪样品的需氧平板计数（APC）为13 CFU/g。在低水平接种（1.1 CFU/25 g）条件下，LAMP和BAM的检出率（POD）均为45%（9/20），处于目标分数检出范围（25%–75%）内；高水平接种（10.8 CFU/25 g）条件下，两种方法检出率均为100%（5/5）；未接种对照均为阴性。LAMP与BAM之间检测单元水平一致率为100%。LAMP与BAM的RLOD为1，落在可接受限度1.5以内。

**生宠物食品验证。** 生宠物食品的APC为3.4 × 10⁵ CFU/g，背景菌群水平较高。在低水平接种（1 CFU/25 g）条件下，BAM检出率为45%（9/20），LAMP检出率为35%（7/20），均在目标分数检出范围内；高水平接种（5.4 CFU/25 g）条件下，两种方法检出率均为100%（5/5）。使用Qiagen试剂盒和PrepMan试剂盒提取DNA时，LAMP的Tp分别为19.0 ± 4.6分钟和15.4 ± 4.0分钟。值得注意的是，PrepMan提取的DNA直接进行LAMP检测时出现明显抑制，经1:10稀释后获得最终结果。LAMP与BAM的RLOD为1.349，在可接受限度1.5以内，表明两种DNA提取方法配合LAMP均能达到与BAM相当的灵敏度。

**讨论与结论**

本研究表明，新开发的基于hlyA基因的单核细胞增生李斯特菌LAMP检测方法在纯培养中具有100%的特异性（101株菌株）和100个细胞/反应的检出限，并且在软奶酪和生宠物食品两种基质中均表现出与FDA BAM培养法相当的检测性能。与BAM培养法相比，LAMP分析48小时增菌液可将获得可靠结果的时间至少提前3天，显著提高了筛查效率。该方法兼容BAM工作流程和多种DNA提取方法（Qiagen试剂盒和PrepMan试剂盒），并采用便携式实时荧光仪进行闭管检测，具有操作简便、无需热循环仪、抗基质抑制能力强等优势。研究还发现，Tp在不同血清型/谱系间存在差异，这可能与hlyA基因的序列变异有关；PrepMan提取法虽然存在抑制问题但稀释后可获得更快的检出时间，值得进一步探索。本研究存在一定局限性，例如验证实验各使用了一种单核细胞增生李斯特菌菌株和一种食品类型，未涵盖菌株和产品类型的变异性。未来需要通过更多人类和动物食品基质的基质扩展研究和多实验室协同验证，进一步评估该方法的适用性，以推动其在FDA现场实验室的常规筛查应用。研究最终得出如下结论：本次方法开发和单实验室验证研究表明，新开发的单核细胞增生李斯特菌LAMP检测方法（分析48小时增菌液并配合多种DNA提取方法）能够快速（检测时间在30分钟内）、特异、灵敏地检出软奶酪和生宠物食品中的低水平单核细胞增生李斯特菌污染（约1 CFU/25 g测试部分）。经过进一步的单实验室扩展研究或多实验室验证后，该方法有望被FDA现场实验室采纳，用于这些食品基质的常规筛查，并与BAM培养法结合使用，以确保产品安全和保护公众健康。