《Frontiers in Immunology》：Leishmania infantum eukaryotic initiation factor 4A modulates in vitro functional activity of human neutrophils
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利什曼病是一组由利什曼原虫（Leishmania）引起的被忽视热带病，其毒力主要依赖对宿主免疫反应的调节。中性粒细胞作为感染部位最早招募的先天免疫细胞，是早期寄生虫控制和疾病转归的关键决定因素，然而其对寄生虫衍生分子的功能活化机制仍知之甚少。本研究探讨了婴儿利
利什曼病是一组由利什曼原虫（Leishmania）引起的被忽视热带病，其毒力主要依赖对宿主免疫反应的调节。中性粒细胞作为感染部位最早招募的先天免疫细胞，是早期寄生虫控制和疾病转归的关键决定因素，然而其对寄生虫衍生分子的功能活化机制仍知之甚少。本研究探讨了婴儿利什曼原虫（Leishmania infantum）真核起始因子4A（LieIF，一种排泄/分泌蛋白）对人中性粒细胞的影响。重组LieIF蛋白刺激诱导了强烈的中性粒细胞促炎反应，表现为活性氧（ROS）产生增加、脱颗粒、晚期凋亡增强，以及IL-8、TNF-α、IL-1β和IL-6细胞因子分泌增多，同时抗炎细胞因子TGF-β1产生减少；未检测到IL-10、IFN-γ和IL-12p70。此外，LieIF激活了p38丝裂原活化蛋白激酶（MAPK），但对AKT、ERK1/2和JNK激酶无影响。使用特异性药理学抑制剂阻断p38后，TNF-α、IL-1β、IL-6和IL-8分泌减少，证实了p38 MAPK在LieIF诱导的中性粒细胞活化中的功能性贡献。这些发现将LieIF鉴定为一种强效的寄生虫源炎症蛋白，其通过p38激酶驱动中性粒细胞活化，突出了其在早期先天免疫反应中的作用，以及其在开发新型治疗和疫苗策略中的潜在价值。
研究背景与立项依据
利什曼病是一组由利什曼原虫（Leishmania）引起、经白蛉传播的被忽视热带病，临床谱从自限性皮肤损害到致命内脏感染不等。疾病严重度与进展主要由宿主免疫反应决定，而感染早期中性粒细胞作为首批抵达接种部位的先天免疫细胞，通过吞噬前鞭毛体、产生活性氧（ROS）、释放中性粒细胞胞外诱捕网（NETs）及分泌趋化因子参与寄生虫控制。然而寄生虫衍生分子如何具体调节中性粒细胞功能仍不清楚。已知表面脂磷酸聚糖（LPG）可诱导NET形成，排泄分泌产物（ESPs）及寄生虫来源外泌体均参与免疫调节；其中真核起始因子4A（LeIF/LieIF）属DEAD-box RNA解旋酶家族，是利什曼分泌组与外泌体组分，在单核/巨噬/树突状细胞中具强促炎与Th1偏向活性，但其对人中性粒细胞的作用尚未阐明。研究人员假设LieIF作为分泌免疫调节剂直接调控中性粒细胞效应功能，从而开展本研究以明确早期先天事件。
主要技术方法概览
研究人员使用来自健康成年志愿者的外周血样本（经突尼斯巴斯德研究所伦理委员会批准），通过密度离心与葡聚糖沉降分离人多形核中性粒细胞（PMNs），纯度经CD16+CD14?流式确认＞97%；重组LieIF由大肠杆菌BL21(DE3)表达并经镍亲和纯化，内毒素＜0.88 EU/mg。功能学上采用CM-H2DCFDA探针测ROS、底物法测髓过氧化物酶（MPO）与中性粒细胞弹性蛋白酶（NE）释放、Annexin V-PE/7-AAD流式测凋亡、ELISA测细胞因子时序分泌；信号机制上用Western blot检测p38/AKT/ERK1/2/JNK磷酸化，并以SB203580（p38）、PD184352（MEK/ERK）、SP600125（JNK）、wortmannin（PI3K/AKT）预处理行药理学抑制验证，部分实验在LieIF预处理后感染L. major（EMPA-12）以观察感染背景下通路维持情况。
研究结果
3.1 重组LieIF表达与中性粒细胞纯度：重组His标签LieIF收率8 mg/L，SDS-PAGE示约45.3 kDa主带；内毒素1.10 EU/mL（0.88 EU/mg）。分离中性粒细胞CD14+污染在分离即刻3.0%、24 h降至1.2%。
3.2 LieIF不影响活力与膜完整性：0.31–5 μg/mL处理18 h，MTT与LDH释放均与未刺激无差异，选2.5 μg/mL作后续非细胞毒浓度。
3.3 诱导ROS产生：2.5 μg/mL刺激2 h，CM-H2DCFDA荧光显著升高（p<0.05），提示NADPH氧化酶为主源。
3.4 诱导脱颗粒：MPO自1 h起释放在18 h达峰后略降；NE自15 min起释放，18 h最高并维持至24 h。
3.5 增加晚期凋亡：18 h时LieIF组早期凋亡由51%降至40%，晚期凋亡约2.5倍升高，总Annexin V+比例不变，坏死＜1.8%，表明LieIF促进晚期凋亡而非延寿。
3.6 细胞因子分泌偏移：TNF-α自1 h可测、18 h达峰；TGF-β1在静息细胞6 h起升、24 h达峰，而LieIF将其压至近基线。综合ELISA显示LieIF强力诱导TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-8，不产IL-10/IL-12p70/IFN-γ。
3.7 选择性激活p38 MAPK：Western示p38 Thr180/Tyr182磷酸化自0.25 h起持续至24 h，AKT/ERK1/2/JNK磷酸化不受影响（RAW264.7+LPS作阳性对照）。L. major感染本身致p38磷酸化，LieIF预处理进一步增强之；SB203580预处理显著削弱LieIF诱导的p38磷酸化。
3.8 p38主导细胞因子产生：SB203580完全取消TNF-α与IL-1β、强抑IL-8、部分降IL-6；PD184352抑TNF-α/IL-1β/IL-8，SP600125抑TNF-α/IL-1β/IL-6，wortmannin仅抑IL-6。结论为p38系LieIF应答中枢，ERK/JNK/AKT提供基础张力支持。
讨论与结论翻译
讨论指出，LieIF以选择性p38 MAPK激活重演了全虫刺激中性粒细胞的ROS、脱颗粒与促炎因子特征，不同于LPG/GP63/膜酸性磷酸酶等免疫抑制分子，近似植物凝集素ArtinM活化谱。LieIF将凋亡动态由早期推晚期，可能影响中性粒细胞寿命及寄生虫暂居胞内转巨噬细胞之双向结局。细胞因子天平（升TNF-α/IL-1β/IL-6/IL-8、抑TGF-β1）符合抗利什曼抵抗表型。受体方面排除TLR4（C3H/HeJ仍响应），TLR2待证。转化上LieIF N端属Leish-111f/LEISH-F1疫苗组分且已达II期，其ATP酶小分子抑制剂具杀虫性，本研究补入其对中性粒细胞这一首批应答细胞的活化维度。
结论：本研究首次系统表征LieIF对原代人中性粒细胞的活化，证明这一保守分泌蛋白通过选择性p38 MAPK通路驱动包含氧化爆发、脱颗粒、细胞因子分泌与凋亡时相改变的协同促炎程序；单一分泌分子足以复现利什曼早期中性粒细胞应答核心特征，凸显LieIF在宿主—寄生虫界面免疫调节效力，为以寄生虫源免疫调节物为靶点的治疗与疫苗设计提供新依据。论文发表于《Frontiers in Immunology》。
