《Phytopathology Research》：The putative four-transmembrane proteins RWTD1 and PRM1 differentially regulate sexual mating, symptom development, and teliospore formation in the sugarcane smut fungus
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由Sporisorium scitamineum引起的甘蔗黑穗病是全球甘蔗最具破坏性的病害之一，导致严重产量损失与长期农业影响。整合膜蛋白是质膜的重要组分，在分子转运、信号转导、致病与防御中发挥关键作用，但其在黑穗真菌有性交配与致病性中的贡献大多未知。研究人员
由Sporisorium scitamineum引起的甘蔗黑穗病是全球甘蔗最具破坏性的病害之一，导致严重产量损失与长期农业影响。整合膜蛋白是质膜的重要组分，在分子转运、信号转导、致病与防御中发挥关键作用，但其在黑穗真菌有性交配与致病性中的贡献大多未知。研究人员在S. scitamineum中表征了两个新型整合膜蛋白——鞭黑与冬孢子发育调控蛋白1（RWTD1）和信息素调控多跨膜蛋白（PRM1）。RWTD1含四个跨膜结构域，在有性交配阶段特异性上调，定位于靠近质膜的胞质离散斑点。在Mat-1单倍体缺失RWTD1彻底废除交配后丝状生长，Mat-2单倍体缺失则丝状化减弱。转录组显示相较野生型，RWTD1突变体中多个整合及固有膜组分编码基因差异表达，包括编码推定四跨膜与七跨膜蛋白的PRM1和DIK6。缺失PRM1重现了ΔRWTD1的交配缺陷。RWTD1、PRM1与DIK6均参与毒力，而RWTD1还调控症状发育与冬孢子形成。该研究证明RWTD1、PRM1与DIK6是甘蔗黑穗病菌毒力与有性交配的重要贡献者。
研究背景与立项依据：甘蔗黑穗病由担子菌Sporisorium scitamineum引起，其致病与有性发育紧密偶联，酵母态单倍体经亲和交配形成双核菌丝并侵入蔗苗分生组织，后期产生黑色鞭状结构与冬孢子。质膜整合膜蛋白占蛋白质编码基因约25%，其中七跨膜G蛋白偶联受体（GPCR）如信息素受体Pra在黑穗菌中已有研究，但四跨膜蛋白在植物病原真菌毒力与孢子发育中的功能鲜有报道，S. scitamineum中此前无任何整合膜蛋白被系统表征。鉴于此，研究人员以交配期转录组上调的推定四跨膜蛋白基因为切入点，筛选并功能解析RWTD1及其共调控网络中的PRM1、DIK6，明确其在交配、致病与冬孢子形成中的差异角色。论文发表于《Phytopathology Research》。
主要关键技术方法：以野生型单倍体JG35（Mat-2）与JG36（Mat-1）及衍生突变体为材料，采用同源重组与PEG介导原生质体转化构建RWTD1、PRM1、DIK6单/双等位缺失株，农杆菌介导回补；RT-qPCR与RNA-seq（0 h与交配72 h）联合WGCNA共表达模块分析定位交配响应膜蛋白调控网络；RWTD1-GFP融合蛋白荧光显微镜亚细胞定位；YEPS共点种评估丝状化交配表型；蔗苗ROC22根浸接种120天统计黑鞭（black whip）率与冬孢子形成；以bE2为标准曲线行TaqMan绝对定量估算分生组织内真菌生物量。
研究结果
RWTD1推定位囊泡样细胞器并在S. scitamineum有性交配中强表达：RT-qPCR确认交配期转录诱导≥8倍；Protter预测四跨膜、N/C端胞外；系统树显示与黑穗菌同源物远缘；RWTD1-GFP在单倍体孢子、双核菌丝及冬孢子近膜胞质呈斑点状，回补株保留交配与致病力。
RWTD1是S. scitamineum有性交配与丝状生长所需：Δ36-RWTD1×JG35完全无菌丝，Δ35-RWTD1×JG36丝状减弱；RT-qPCR显示a位点（mfa、pra）与b位点（bE、bW）多数下调，Mat-1背景缺失对 filamentation 抑制更重，表明RWTD1通过维持信息素与前体受体转录保障交配。
RWTD1缺失改变交配期膜相关基因表达：RNA-seq（各组合0 h/72 h）PCA聚类可靠，野生型特有512个交配差异基因；GO富集“整合膜组分”“固有膜组分”；WGCNA的MEturquoise模块（558基因）与野生型72 h正相关、与双缺负相关；取交集得37个膜相关核心基因，含PRM1（四跨膜）与DIK7/DIK6（七跨膜）。
PRM1而非DIK6是S. scitamineum有性交配所需：ΔPRM1双缺显著削弱丝状化，a位点mfa1/mfa2/pra1/pra2与bE1下调、bE2/bW2上调，RWTD1反馈下调；ΔDIK6交配正常，说明PRM1处RWTD1下游且二者双向调控，DIK6不参与交配。
RWTD1与PRM1对冬孢子形成与症状发育不可或缺：ROC22蔗苗接种120天，野生型黑鞭率91%；ΔRWTD1双缺无黑鞭无冬孢子且侵染率低（7/98），单缺Mat-1背景（JG35×Δ36-RWTD1）有侵染无黑鞭，Mat-2背景（Δ35-RWTD1×JG36）无黑鞭高侵染，呈现交配型依赖；ΔPRM1双缺黑鞭54.4%，ΔDIK6双缺24.3%；bE2绝对定量显示ΔRWTD1双缺分生组织真菌生物量最低。
讨论部分总结：四跨膜蛋白RWTD1不同于U. maydis Sho1（带SH3互作Kpp6）或典型四跨膜Tetraspanin（胞质N/C尾），其N/C端胞外、无已知结构域，可能经胞外环感知信号或囊泡–细胞器间物质交换调控；系统树远缘提示S. scitamineum特异进化。RWTD1与PRM1缺失均致a/b位点转录失衡且互为下调，提示共用不对称交配型调控网络，RWTD1调控面更广、处PRM1上游。交配丝状化与毒力可解偶：ΔPRM1丝状弱仍产黑鞭54.4%，ΔDIK6交配正常但毒力降至24.3%，ΔRWTD1双缺完全无黑鞭，说明RWTD1独有症状与冬孢子转换功能。该工作为黑穗菌膜蛋白调控有性发育与致病提供首例证据，RWTD1/PRM1可作宿主诱导基因沉默（HIGS）靶标。
结论译文：研究人员明确了两个推定四跨膜蛋白RWTD1与PRM1在S. scitamineum有性交配与毒力中的关键角色。RWTD1突变体因膜蛋白集（含PRM1、DIK6）表达改变而交配与丝状化减弱；PRM1突变体重现RWTD1交配缺陷；RWTD1、PRM1、DIK6缺失均不同程度削弱毒力，而仅RWTD1参与症状发育与冬孢子形成。研究为植物病原真菌整合膜蛋白介导有性生殖与毒力调控提供新见解。
