《Journal of Hematology & Oncology》：Glutathione reductase deficiency potentiates the immunogenicity of ferroptosis and cuproptosis via amplified reactive oxygen species accumulation and cGAS-STING pathway activation
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摘要
背景：癌症因其耐药性和转移仍然是主要的治疗挑战，这些过程由氧化应激和氧化还原失衡驱动。通过铁死亡（ferroptosis，铁依赖性脂质过氧化）和铜死亡（cuproptosis，铜驱动的线粒体功能障碍）这两种活性氧（ROS）介导的细胞死亡通路来靶向这一脆
摘要
背景：癌症因其耐药性和转移仍然是主要的治疗挑战，这些过程由氧化应激和氧化还原失衡驱动。通过铁死亡（ferroptosis，铁依赖性脂质过氧化）和铜死亡（cuproptosis，铜驱动的线粒体功能障碍）这两种活性氧（ROS）介导的细胞死亡通路来靶向这一脆弱性，提供了一种有前景的治疗策略。然而，对其氧化还原调控认识不充分以及免疫原性有限，阻碍了临床转化。
方法：研究人员进行了全基因组CRISPR敲除筛选，以鉴定铁死亡的关键调控因子。在多种癌细胞系中评估了候选基因的遗传缺失或药理学抑制对铁死亡诱导剂RSL3和铜死亡诱导剂艾乐司莫（elesclomol，Es）敏感性的影响。在异种移植、原位、转移性和同基因小鼠模型中评估了单药或联合免疫检查点抑制剂的抗肿瘤疗效。机制研究还检测了ROS产生、线粒体应激、线粒体DNA释放、cGAS-STING激活以及肿瘤微环境中的免疫应答。
结果：谷胱甘肽还原酶（GSR）——维持还原型谷胱甘肽（GSH）稳态的核心酶——被鉴定为铁死亡的头号抑制因子。GSR敲除或药理学抑制显著提高了多种癌细胞系对RSL3诱导的铁死亡的敏感性，而GSR过表达则赋予耐药性。引人注目的是，GSR耗竭还增强了对铜离子载体Es触发的铜死亡的敏感性。在多个体内肿瘤模型中，GSR抑制与RSL3或Es协同抑制肿瘤生长、抑制肺转移并延长生存期。机制上，GSR缺乏在铁死亡或铜死亡应激下放大了ROS产生，诱导线粒体应激，并触发胞质线粒体DNA释放，在体外和体内激活cGAS-STING通路。这增加了炎症细胞因子的产生，促进了免疫原性细胞死亡，并增强了损伤相关分子模式（DAMPs）的释放，包括HMGB1。总之，GSR抑制与铁死亡或铜死亡诱导剂联合使用，将肿瘤微环境转化为高度免疫刺激状态，从而通过增强树突状细胞活化和T细胞浸润与激活来提升免疫检查点阻断的疗效。
结论：GSR是通过氧化还原调控连接并调节铁死亡和铜死亡的关键分子节点。靶向GSR可放大ROS介导的免疫原性细胞死亡，触发癌细胞中的cGAS-STING激活，并增强癌症免疫治疗的疗效，提供了一种有前景的基于氧化还原的治疗策略。
**论文解读：GSR作为铁死亡与铜死亡共同调控节点及其免疫原性增强机制**
**一、研究背景与科学问题**
癌症治疗面临的核心挑战在于耐药性与转移，二者与肿瘤细胞中活性氧（reactive oxygen species, ROS）的过度产生及氧化还原稳态失衡密切相关。癌细胞在高速增殖过程中产生大量ROS，同时通过上调抗氧化防御系统（如NRF2-KEAP1轴）来维持存活。谷胱甘肽（glutathione, GSH）作为最丰富的胞内抗氧化剂，其稳态由谷氨酸-半胱氨酸连接酶（GCL）和谷胱甘肽还原酶（glutathione reductase, GSR）共同维持。铁死亡（ferroptosis）和铜死亡（cuproptosis）是两种金属依赖性的调节性细胞死亡（regulated cell death, RCD）形式，分别由铁依赖性脂质过氧化和铜驱动的线粒体功能障碍介导。尽管两者在机制上具有金属依赖性和线粒体损伤等共同特征，但是否存在可协同调控两条通路的共同上游开关尚不明确。此外，铁死亡和铜死亡的免疫原性高度依赖于细胞环境，尤其是铜死亡的免疫特性尚未被系统表征。因此，寻找能够同时增强这两种死亡途径敏感性并提升其免疫原性的关键分子，对于开发新的癌症治疗策略具有重要意义。
**二、研究目的与主要发现**
本研究旨在通过全基因组CRISPR筛选鉴定铁死亡的关键调控因子，并探索其是否也能调控铜死亡及免疫原性。研究发现GSR是铁死亡最强的负调控因子，其缺失或药理学抑制不仅能显著增敏铁死亡，还能增敏铜死亡。机制上，GSR缺乏通过放大ROS积累、诱导线粒体应激和线粒体DNA（mtDNA）释放，激活cGAS-STING通路，将这两种细胞死亡转化为强免疫原性事件，并与免疫检查点抑制剂（ICI）协同增强抗肿瘤免疫。该研究发表在《Journal of Hematology》。
**三、关键技术与方法**
研究者使用了多种关键技术：全基因组CRISPR/Cas9敲除筛选（Brunello文库，SH-SY5Y-Cas9细胞，RSL3处理筛选）；慢病毒介导的基因敲除/过表达及回复实验；体外细胞活力、克隆形成、细胞死亡及脂质过氧化检测；GSR酶活性及GSH水平测定；线粒体应激和mtDNA释放检测（MitoTracker、MitoSOX、PicoGreen染色及胞质mtDNA定量）；cGAS-STING通路蛋白检测（Western blot、免疫荧光）；骨髓来源树突状细胞（BMDC）共培养和流式免疫分型；多种小鼠肿瘤模型（异种移植、原位、转移、同基因模型）及抗PD-1联合治疗；临床队列生物信息学分析（TIDE、CIBERSORT、ssGSEA等）。
**四、研究结果**
**1. GSR决定铁死亡敏感性**：通过全基因组CRISPR筛选，GSR被鉴定为RSL3处理下细胞增殖的头号必需基因。GSR敲除（KO）在多种癌细胞系中显著增强RSL3诱导的细胞死亡，而过表达GSR则赋予耐药性。GSR的酶活性是必需的，催化失活突变体无法恢复耐药性。RSL3处理的GSR-KO细胞表现出脂质过氧化升高和PTGS2、CHAC1表达上调，且细胞死亡可被铁死亡抑制剂Fer-1和Lip-1完全挽救，但不受凋亡或坏死性凋亡抑制剂影响。CTRP数据库分析显示GSR表达与多种铁死亡诱导剂耐药呈正相关，且在神经母细胞瘤等肿瘤中高GSR与不良预后相关。药理学GSR抑制剂BCNU可模拟遗传敲除效应。
**2. GSR缺乏增敏铜死亡**：GSR-KO或药理学抑制（BCNU、LCS3、2-AAPA）显著增强铜离子载体Es联合Cu2?（Es-Cu）诱导的细胞死亡，而野生型GSR回复可逆转这一效应。GSR缺乏促进铜死亡标志物DLAT的聚集，补充GSH可阻断该聚集。GSR缺失诱导的细胞死亡可被铜螯合剂TTM、GSH或NAC挽救，但不被凋亡、坏死性凋亡或铁死亡抑制剂挽救，表明GSR是连接铁死亡和铜死亡的共同调控节点。
**3. GSR缺乏在体内增强铁死亡和铜死亡介导的肿瘤抑制**：在裸鼠异种移植模型中，GSR-KO的SH-SY5Y肿瘤对RSL3或Es治疗更敏感，表现为肿瘤生长减缓、生存期延长，并伴随Ki67降低、HMGB1释放、CRT暴露及4-HNE增加。在同基因4T1模型中，回复野生型GSR可恢复肿瘤对Es的耐药性，而催化失活突变体不能。BCNU与RSL3或Es联合在原位乳腺癌和肺转移模型中显著抑制肿瘤生长和转移，且该效应可被铁死亡抑制剂（Lip-1、RSG）或铜死亡抑制剂（TTM）分别阻断。在GSR-KO细胞中，BCNU的增敏效应消失，表明其组合效应主要归因于GSR抑制。
**4. GSR缺乏增强铁死亡和铜死亡的免疫原性细胞死亡**：GSR-KO或BCNU联合RSL3/Es-Cu显著增加细胞外ATP、HMGB1释放和CRT暴露。处理后的肿瘤细胞培养基可促进BMDC成熟，并升高IFN-γ、TNF-α、IL-6等细胞因子。HMGB1中和抗体或TLR4抑制剂TAK-242可显著削弱这些效应，表明HMGB1-TLR4信号在免疫激活中起关键作用。
**5. GSR缺失重塑肿瘤免疫微环境**：在免疫健全CT26和4T1模型中，BCNU联合RSL3或Es显著增加CD4?、CD8? T细胞和CD11c? DC浸润，降低MDSC、M2型巨噬细胞和调节性T细胞比例，并减少CD8? T细胞耗竭。分离自治疗组肿瘤的CD8? T细胞表现出更强的体外杀伤活性。体内细胞耗竭实验证明CD8? T细胞是疗效的主要依赖群体，CD11c?细胞也有重要贡献。
**6. GSR缺乏通过线粒体应激和STING通路激活诱导免疫原性死亡**：GSR缺乏联合铁死亡/铜死亡诱导剂显著增加总ROS和线粒体超氧化物，诱导线粒体碎片化。处理导致胞质mtDNA释放增加，释放依赖于mPTP和BAX/BAK介导的MOMP。胞质mtDNA激活cGAS-STING通路，表现为cGAS、p-STING、p-TBK1、p-IRF3升高及cGAMP增加。STING敲除或抑制可消除炎性因子释放和DC活化，并削弱体内肿瘤再攻击模型的保护性免疫记忆。
**7. GSR抑制增强免疫检查点抑制剂疗效**：在4T1和CT26模型中，抗PD-1 + BCNU + RSL3/Es三药联合显著优于双药联合，抑制肿瘤生长并延长生存期，同时增强CD8? T细胞IFN-γ和GZMB产生。临床队列分析显示，GSR高表达与ICI治疗不良预后相关，GSR与PD-L1联合可作为潜在的疗效预测生物标志物。
**五、讨论与结论**
讨论部分指出，GSR作为连接铁死亡和铜死亡的代谢枢纽，通过调节GSH稳态同时影响脂质过氧化物清除和铜缓冲能力。虽然两种死亡途径上游机制不同，但共享线粒体功能障碍和先天免疫激活的下游通路。GSR抑制将非凋亡性细胞死亡转化为强免疫原性事件，为治疗耐药性肿瘤提供了新策略。研究局限性包括BCNU非高度选择性、未能完全区分肿瘤固有与宿主GSR贡献等。结论强调，GSR是联系氧化还原失衡与抗肿瘤免疫的分子节点，靶向GSR可增强金属依赖性RCD疗法和免疫治疗的疗效。
