《International Journal of Legal Medicine》：Biological matrices for determining the origin of post-mortem ethanol: Recommendations for collection and storage
乙醇是全球使用最广泛的精神活性物质之一，也是法医毒理学实验室最常检测的物质之一。在法医尸检中选择最合适的生物样本用于乙醇筛查极为重要，主要目的是区分生前饮酒与死后形成的乙醇，同时降低乙醇因氧化或代谢而损失的风险。因此，本研究对近期关于法医尸检过程中采集的生物基质用于检测乙醇及其代谢物的采集、储存及可用性的文献进行了整合性综述，并考虑了尸体的死后状态和腐败程度。研究检索了Scopus、Web of Science和PubMed数据库，检索限定为过去10年内发表的英文文章，排除了综述和荟萃分析。采用语言和时间限制是为了确保方法学一致性、语言同质性、国际读者的可及性，并聚焦于当前法医毒理学实践相关的近期证据。在排除重复文献后，初步筛选识别出414篇文章。在分析标题、摘要和全文后，排除了无法获取全文、研究设计不当、出版物类型不正确或内容偏离主题的文章。通过对最终纳入的54篇文章进行详细分析，收集了研究目标、主要结果、采集与储存建议以及潜在生物标志物等数据。总体而言，建议分析多种基质类型和生物标志物，双份采集样本，根据储存时间选择冷藏或冷冻，使用防腐剂，并提供充分的人员培训。能够在结果之间提供更高清晰度并更真实反映实际条件的方案对于调查具有重要意义，可预防或检测生物样本中乙醇水平的变化，从而确保证据从采集到法庭呈交的有效性、完整性和可追溯性。
引言
血液酒精浓度可能与多种暴力死因相关，如交通事故、他杀、自杀及其他犯罪。因此，在法医尸检背景下，了解饮酒（或不饮酒）在死亡案例中的影响并准确确定死因至关重要，可为法律调查、公共卫生政策和事件预防提供关键信息。准确识别体内酒精水平对于确定该物质是导致死亡的因素还是直接死因至关重要。血液酒精浓度可影响个体的精神和身体状态，从而影响其反应能力和判断力。这些信息对于理解死前行为和评估酒精与后续事件之间的可能关系具有重要价值，进而影响法医学解释、调查结论和司法裁决。
多种因素使死亡情境中饮酒情况的判定变得复杂，因为死后体内乙醇浓度可能通过转化为乙醛而降低，也可能通过微生物从碳水化合物进行的酒精发酵而升高。这一现象将葡萄糖分解为乙醇和二氧化碳，产生死后乙醇。死后乙醇的发酵生成不仅在腐败尸体中观察到，在保存条件不当的样本中也会出现，如高温或缺乏氟化钠(NaF)等防腐剂。这些因素与产生与生前酒精摄入无关的假阳性结果的可能性直接相关。
此外，病理状况可促进乙醇的新生形成；研究报道了糖尿病患者死后血液中显著的乙醇水平。乙醇的产生似乎仅受底物可用性（主要是葡萄糖）的限制。随着底物对微生物发酵的可用性增加，体液和组织中的乙醇浓度可能升高。因此，高血糖状态（如糖尿病中所见）可增加酒精发酵产生的乙醇量。
法医毒理学当前的一个趋势是检查生物基质之间的相关性，以阐明乙醇的来源及其与生前摄入的关系。死后样本中酒精代谢物（如乙基葡萄糖醛酸苷(EtG)和乙基硫酸盐(EtS)）的存在与死前饮酒直接相关。在腐败尸体中，EtG的鉴定至关重要，因为它不来源于微生物作用下的葡萄糖发酵，因此不是内源性酒精。另一个需要考虑的方面是氧化导致的乙醇潜在减少及副产物的生成，这在最终需要对样本进行重新评估时是一个重要因素。
汇总科学文献中的信息可以为在不同条件下实验室鉴定乙醇选择最合适的采样方法提供依据，并有助于阐明假阳性和假阴性结果，从而优化与死后乙醇分析相关的法医学服务和活动。因此，本研究对近期关于死后生物基质用于检测酒精及其代谢物的采集、储存和可用性文献进行了整合性综述，有助于区分生前摄入与死后合成和/或降解。
方法学
本综述的开展遵循六个步骤：（1）确定主题并选择假设或研究问题；（2）建立研究纳入和排除标准/采样或文献检索标准；（3）定义从所选研究中提取的信息/研究分类；（4）评估纳入整合性综述的研究；（5）解释结果；（6）呈现综述/知识综合。
为指导研究，使用TQO缩写构建了研究问题。在该缩写中，“T”反映研究的核心主题（死后乙醇来源的检测）；“Q”指限定词，即与主题相关的特征或程序（合格生物基质的采集和储存技术）；“O”指对象、机构或研究设备（法医实验室）。因此，根据TQO缩写提出的研究问题是：“用于检测死后乙醇来源的生物基质有哪些可能性，其采集和储存建议是什么？”
通过分析研究问题的组成术语来选择关键词。因此，在2024年11月，借助布尔运算符“AND”和“OR”，使用以下描述符在Scopus、Web of Science和PubMed数据库（通过Capes期刊平台）进行了检索：(alcohol OR ethanol) AND (detection OR determination OR analysis OR interfering OR biomarkers) AND (post-mortem OR ante-mortem)。使用检索过滤器选择过去10年（2014年至2024年）发表的英文文章；排除了综述和荟萃分析文章。Rayyan综述管理平台协助了后续的选择步骤。去除重复文献后，根据纳入标准筛选标题和摘要。当文章为综述或荟萃分析、无法获取全文、研究设计或出版物类型不合适或超出综述范围时，将其排除在纳入整合性综述的研究集之外。然而，在文本中适当引用了相关的次要来源，以提供方法学方面的背景或支持讨论。
结果与讨论
排除重复文献后，初步筛选识别出414篇文章（图1）。在分析这些文章的标题和摘要后，排除了不符合本整合性综述主题的文章（327篇）。在最终筛选阶段，在分析其余87篇文章的全文后，排除了33篇（由于全文不可用、研究设计不正确、出版物类型不正确或超出范围）。
图1
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研究筛选和选择过程的PRISMA流程图
基于对最终纳入的54篇文章的详细分析，收集了以下数据：作者、发表年份、研究目的、地点、研究类型、期刊名称、主要结果、结论、合格生物基质以及采集、储存和生物标志物检测的建议。这些信息用于构建表1、表2和表3。
表1 纳入整合性综述的文章特征
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表2 纳入整合性综述的文章主要发现摘要
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表3 考虑到生物基质和尸体状况的乙醇来源检测建议摘要
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法医乙醇分析的生物标志物
多年来，潜在的生前饮酒新标志物不断成为研究对象。然而，与现已确立的标志物如EtG和EtS相比，其结果并不令人满意。2014年，Rainio等人[73]研究了碳水化合物缺乏转铁蛋白(CDT)与乙醇消耗之间的关系，并得出结论，EtG在死后间隔(PMI)中是一种更敏感、特异且稳定的生物标志物，尤其是在尿液和玻璃体液(VH)样本中。
Chen等人[50]证明了生前饮酒与EtG/EtS检测之间的选择性关联，因为这些生物标志物在死者和活体个体的乙醇阴性血样中未被鉴定出来。然而，在乙醇阳性的样本中，检测到EtG和EtS浓度，并随时间推移而降低。因此，EtG和EtS是确定生前乙醇摄入的可靠生物标志物；然而，它们在腐败过程中浓度迅速下降[50]。
为确定法医案例中乙醇的来源，建议除代谢物分析（如乙醛）外，还应检测EtG和EtS标志物。然而，当EtG和EtS结果相互矛盾时，尽管EtG更敏感，EtS被认为是排除生前饮酒的更可靠标志物，因为它在死后血液分析中更稳定，特别是在高温或严重腐败条件下[45]。
由于稳定性较低，EtG在高度腐败过程中可能被降解，导致假阴性结果。相比之下，EtS即使在严重腐败条件下也保持稳定，使其在高度腐败的血样中成为更可靠的标志物[18, 45, 50, 58]。因此，Neumann等人[58]认为在VH（更高的无菌性）中测量EtG更适合腐败案例。此外，葡萄糖可促进发酵并增加乙醇浓度。然而，EtG和EtS不会在死后高血糖条件下自发形成；因此，它们的检测支持死前的代谢活动，并可能有助于确认生前乙醇摄入，包括糖尿病案例[17]。标志物解释应始终考虑死后情境，因为某些化合物可能根据生物基质、保存条件和腐败程度而具有不同含义。
乙醛有三种可能的解释（表3）；最不稳健的是作为生前乙醇消耗的标志物，仅有一位作者支持[37]。该研究通过氧化应激的视角分析生物标志物；因此，它将生物体液（如血液、VH和脑脊液(CSF)）中乙醛的存在解释为与酒精中毒直接相关的毒性代谢物。乙醛在乙醇被乙醇脱氢酶(ADH)和乙醛脱氢酶(ALDH)氧化过程中形成，可与蛋白质反应形成加合物，改变其功能和酶活性，导致氧化应激和细胞损伤[50]。在Maciejczyk等人[37]的背景下，其存在在测试样本中得到定性确认。然而，未观察到与氧化应激生物标志物的关联，这可能归因于死后过程（自溶和腐败）对结果的影响。
解释乙醛的存在是复杂的，因为其来源难以确定；它可能来自细菌活动、酵母发酵、乙醇氧化、腐败或血液保存条件不当[50, 52]。研究还表明乙醛在某些分析中可能是人为产物[52]。因此，准确解释需要全面评估，不仅考虑乙醛本身，还要考虑其他检测到和未检测到的化合物。由于乙醛可由乙醇氧化形成，其存在而没有乙醇和/或1-丙醇可能表明乙醇氧化及随之而来的乙醇损失[22, 31, 56]，特别是在极端储存条件等特定情况下[56]。定量方面也很重要，因为在乙醇、1-丙醇和1-丁醇存在下，异常高的乙醛浓度（> 0.14 mg/ml）可能表明微生物腐败/新生形成[50, 52, 64, 67]。
在保存完好的尸体和活体个体中，乙醛浓度保持在稳定范围内（≤ 0.14 mg/ml）[50]。在高度腐败的尸体中，乙醛浓度显著升高（> 0.14 mg/ml），表明与死后腐败相关[50]。乙醛是Ceciliason等人研究中最常见的挥发性化合物（83%的案例）[52]，通常与微生物新生形成（乙醇、1-丙醇和/或1-丁醇）以及表现出显著更高新生形成迹象的案例同时出现。
在腐败尸体特征的微生物发酵过程中，细菌和酵母菌（如光滑念珠菌）利用可用的葡萄糖产生乙醇，使得区分生前饮酒和死后内源性产生的乙醇变得困难[17]。然而，乙醇的新生形成可能在外部腐败迹象显现之前就已发生[52]。腐败的初始阶段（前3天）往往有更多的新生形成，因为此时葡萄糖——细菌发酵使用的主要底物——可用量更大[40, 51]。因此，血糖控制不佳的糖尿病患者可能表现出更大程度的死后乙醇产生。
Al-Asmari、Altowairgi和Al-Amoudi [34]认为VH是糖尿病患者分析的最佳基质（与尿液相比），因为它更能防止可能的污染，且不易受大量饮水（可显著降低尿液中EtG水平）、增加尿流的药物使用以及糖尿的存在等因素的影响。然而，所有分析的体液样本都容易发生乙醇新生形成，包括VH。这使得PMI和温度成为基本变量。
通常，小于24小时的PMI不足以让微生物将葡萄糖发酵为酒精，尤其是在零度以下温度。然而，在糖尿病患者中，新生形成可在更短的时间间隔内发生。因此，在失代偿性糖尿病案例中，由于丙酮水平升高，低于0°C的储存更为关键。在糖尿病中，尿液中丙酮的存在与乙醇新生形成相关，特别是在腐败和较长PMI的案例中[76, 77]。
丙酮是脂肪代谢过程中产生的天然代谢物，其浓度在长时间禁食、失代偿性糖尿病（糖尿病酮症酸中毒）或生酮饮食等情况下可能升高[62]。在死后分析中，丙酮可能由微生物发酵或组织分解形成。当检测到丙酮时，应将结果与其他基质的结果进行比较并分析背景，以排除其他解释，如外部污染或代谢状况（包括糖尿病酮症酸中毒）。
异丙醇和丙酮应一起解释，因为它们的毒代动力学特征不同[78, 79]。异丙醇代谢为丙酮，其血液消除半衰期较短，约为2.5至8小时，而丙酮持续时间更长，平均血液消除半衰期约为22小时[79,80,81]。丙酮也可能来源于内源性代谢状况，如酮症或糖尿病酮症酸中毒，并且即使在无外源性摄入证据的情况下，酮症酸中毒中也可能检测到异丙醇[79, 82,83,84]。因此，可定量的死后异丙醇浓度可能反映不同的来源，包括外源性摄入、由丙酮内源性形成、污染或死后产生。因此，在解释死后结果时，应考虑异丙醇和丙酮的相对浓度，结合案例史、腐败状态和其他毒理学发现[78, 79]。
因此，异丙醇的发现应谨慎解释，特别是在腐败或特定代谢状况的案例中。在无丙酮的情况下检测到异丙醇可能提示样本采集后的体外污染，或较少见地为生前摄入，具体取决于案例背景[71]。Lekskulchai [69]报道，在高浓度下，异丙醇可能干扰乙醇分析；然而，该局限性与VITROS检测系统相关。目前，色谱技术提供了更高的分析特异性和灵敏度。
死后发生的蛋白质降解释放氨基酸，其发酵产生高级醇。然而，这种产生在变性血液的微生物培养中并不受青睐，可能是由于缺乏合适的氨基酸，表明死后环境中的底物可用性可能影响结果[51]。这些醇的产生速率和浓度低于乙醇[51]。例如，据报道微生物乙醇新生形成的浓度范围为0.01至0.57 g/L，而1-丙醇的检测浓度低得多，范围为0.006至0.053 g/L[40]。此外，已提出0.104 mg/dL的血液1-丙醇临界值作为鉴定死后微生物乙醇产生的标准[55]。
1-丙醇被认为是与腐败和死后乙醇产生最密切相关的高级醇[40, 51, 64]。在Boumba等人[42]的研究中，腐败样本比非腐败样本显示出更高浓度的1-丙醇；1-丙醇与1-丁醇显著相关；其他高级醇仅在1-丙醇存在时检测到，且频率相当低，表明有共同来源。然而，有证据表明，这些醇指向微生物乙醇产生，不仅限于腐败案例[42]。因此，与摄入标志物结合使用时，1-丙醇（一种新生形成标志物）可有助于判定，特别是在（但不限于）腐败案例中[28]。与其他研究相反，Wang等人[45]和Chen等人[50]不认为1-丙醇是可靠标志物。
另一个增长的研究领域涉及多物质使用标志物，这可能有助于检测酒精和其他药物的同时消耗。乙酯5 F-PB22-Et的稳定性使其成为同时使用乙醇和合成大麻素的有前景的血液生物标志物，因为乙酯具有更长的半衰期，从而延长了这些物质的检测时间[26]。头发样本可通过检测EtG和古柯乙烯来指示慢性酒精滥用和同时使用可卡因。因此，建议进行联合生物标志物分析以降低错误解释的风险[70, 74]。
最后，遗传和表观遗传学研究探索了与酒精使用和酒精相关疾病相关的潜在标志物。Vezzoli等人[64]强调了负责乙醇葡萄糖醛酸化的酶中的遗传多态性可能是饮酒后EtG合成个体差异的基础。八年后，Meyer-Bockenkamp等人[35]提出了与酒精使用障碍相关的未来标志物建议，显示了与男性相关的性别依赖性差异。由于GABBR1调节奖赏系统并促成成瘾的神经生物学，该研究表明GABBR1基因中CpG-4的低甲基化可能作为酒精使用障碍的可能外周标志物。此类发现如果得到证实，将使表观遗传学成为法医分析的盟友；鉴于确定个体曾经有（或没有）哪些习惯的可能性，这可能成为报告中的一个区分因素。
用于法医乙醇分析的生物基质
为最大限度地减少采集后血液乙醇浓度的降低，应按照严格的方案采集样本，在适当条件下储存和维护，并由接受定期技术更新培训的工作人员处理[28]。更具体地说，一些研究使用中心静脉血[29, 45]；然而，由于死后重新分布的风险，外周血更可取[72]，通常在股静脉采集以避免其他体液的污染[19]。
在法医案件中，可能存在无尸体可用、仅有血迹或涉及失血过多的情况。由于乙醇具有挥发性，Wang等人[44]讨论了使用干血斑检测稳定的非氧化性乙醇代谢物（如EtG和EtS）而非乙醇本身。某些分析物在干血斑中比在全血中更稳定，EtG是最显著的例子。这种方法还可便于储存和运输，因为它不需要冷藏或冷冻，降低了污染风险，需要更少的血量（< 100 μl），并提供侵入性更小的采集方法。
尽管血液是法医分析中的主要基质，但它并不总是可用或可行的。此外，强烈建议使用多种基质以提高准确性。尿液是与血液相关性最强的基质，有助于解释死后检测到的乙醇来源。与血液相比，健康个体尿液中微生物定植的概率通常较低，因为它不含葡萄糖，降低了发酵风险，可能无需使用防腐剂[18, 57]，但糖尿病受害者或尿液被白色念珠菌等微生物制剂污染的情况除外（免疫抑制个体或患有妇科和泌尿系统感染的个体）[57]。这是因为糖尿可作为底物，通过微生物发酵促进死后乙醇的产生[40]。
在其优势中，Maciejczyk等人[37]确定尿液是腐败情况下的最佳基质。在Santhosh等人[38]中，EtG在尿液样本中用作近期饮酒的生物标志物。尿液中EtG的检测窗口远大于乙醇；因此，在疑似酒精相关死亡的调查中应常规考虑[66]。然而，存在分歧：Dip和Mozayani以及Szeremeta等人[17, 60]认为玻璃体液是腐败案例和糖尿病个体的最佳基质。由于其解剖位置，玻璃体液最不易受分解或与糖尿病相关的糖尿引起的变化影响，使其成为毒理学调查的宝贵样本，特别是在高度腐败阶段的尸体[58, 73]和发生在户外的死亡中，因为在这些情况下死后乙醇产生率更高[76, 77]。例如，Neumann等人[58]报道EtG在高度腐败的血液中可能消失；因此，在VH中测量EtG更合适。由于EtG是乙醇的直接代谢物，可用作监测近期饮酒的生物标志物，其在玻璃体液中的检测可为死前饮酒提供额外信息[58]。
将VH作为常规基质纳入是强烈推荐的[49, 57, 75]。这是因为，除了更高的EtG检出率（与血液和尿液相比）及其对微生物污染的较低敏感性外，在不同基质（股血、尿液和VH）中分析乙醇浓度及其代谢物的组合提供了互补信息，因为分布和消除速率存在差异，这有助于解释死前饮酒习惯[57, 75]。从实际尸检角度来看，VH采集具有优势，因为它提供更少的微生物污染、更低的分解倾向、采集简便（通过穿刺眼球从双眼采集）、更简单的预处理要求、分析过程中干扰少以及死后化合物的稳定性[19]。
然而，即使是VH也并非万无一失。Szeremeta等人[60]提请注意环境条件如何影响腐败或部分炭化尸体中的血液水合作用，这可能改变酒精浓度；在溺亡案例中，酒精从VH扩散到周围水中可能阻碍死亡时酒精水平的准确测定；死亡与样本采集之间的时间间隔可能影响酒精浓度，尽管该研究未发现BAC和VHAC之间存在显著差异。
乙醇是一种小的极性分子，在体内富含水的区域积累[67]。在健康成人中，平均血液含水量为80%（w/w），但该值在死后通常会降低，具体取决于PMI[85, 86]。因此，理论上，流失了大量体液的尸体可能呈现比死亡时观察到的更高的乙醇浓度。因此，建议在尸检期间测量血液水分，并将乙醇含量校正至80%（w/w）的标准水分含量，以补偿死后血液稀释或腐败，从而更准确地估计生前血液酒精含量[85]。VHAC和静脉血酒精浓度在统计学上显著相关。在这项研究中，在所有年龄段、性别和采集与分析之间的时间间隔内，乙醇浓度最高的基质是VH。死亡与样本采集之间的时间（PMI）以及性别对血液和VH之间乙醇浓度差异无显著影响。这一局限性得到了Jones和Holmgren[87]研究结果的支持，他们报告了VH/股静脉血乙醇比率的广泛一致性限度，并告诫不要直接从玻璃体液测量值估计股静脉血乙醇浓度，强调玻璃体液主要应作为补充基质来解释。
对其他不太常见的酒精研究替代基质的研究正在增加。例如，CSF是死后乙醇检测的可行样本；可从脊髓管[20, 37]或脑室[46, 73]采集。与VH一样，与其他身体部位相比，CSF更孤立，可用葡萄糖更少，使得可能在死后产生内源性乙醇的细菌更难进入，与血液相比表现出更大的稳定性，并且是确定乙醇中毒状态的有价值的替代方法，特别是在腐败尸体或无法采血的情况下[20]。
然而，由于大脑是高度细胞化和代谢活跃的器官，死后迅速分解，从而更容易污染脑室的CSF[20]。从脊髓管（主要来自深层）采集的CSF被认为不易受死后变化和污染的影响，因为它更孤立，更少暴露于分解和脑组织污染[20]。此外，脊柱周围蛛网膜下腔中的CSF保持更清洁且受影响更小，因为由于重力效应它不太停滞。相比之下，脑室中的CSF具有更高的细胞更新率，且更接近易分解的高度活跃脑组织[20]。
在寻找新的替代方法时，Tomsia等人[57]在液氮存在下用低温研磨机分析了研磨的肋软骨，以及通过手术刀手动碎裂获得的未研磨肋软骨。在研磨样本分析中观察到更高的精度，因为与血液和尿液中的乙醇浓度有很强的相关性。研磨样本中的乙醇水平与PMI成反比，这意味着死亡与尸体发现之间的间隔越长，乙醇浓度越低，与血液和尿液样本中发生的情况类似。然而，在未研磨软骨中未观察到显著程度。
观察到的差异可能归因于对每种样本类型的处理。经受低温研磨的样本在整个过程中保持在低温下，而未研磨样本是手动碎裂的。不能排除未研磨软骨可能无法有效检测低浓度乙醇的可能性，因为室温下进行的粗碎裂导致基质中可用物质含量低。肋软骨有局限性，包括制备耗时和需要专门设备。此外，未来的法医研究应考虑样本被血液或肌肉组织残留物污染的可能性。然而，这种基质作为分析高度腐败或肢解尸体的替代方法是有前景的。
在源自身体部位的尸体生物基质选项中，以下也可作为可行样本引用：脑组织中高级醇（丙酮、异丙醇、甲醇和1-丙醇）的测量[62]，以及头发样本中EtG和多物质使用标志物的测量[70, 74]。然而，法医昆虫学带来了另一种感兴趣的生物基质：食尸性昆虫。尽管是初步的，但基于Lambiase等人[63]的结果，EtS被证明是昆虫学基质中有前景的酒精摄入标志物：更高的稳定性；即使在复杂基质中也能获得一致结果（更少的基质抑制效应）；无死后产生；在分析的所有食尸性昆虫（反吐丽蝇）幼虫和蛹样本中均检测到，包括来自真实案例的样本。这些发现证明了法医科学中分析可能性的多样性和多功能性。然而，无论基质类型如何，适当的样本处理都是基础（表3）。
用于法医乙醇分析的生物样本保存
法医背景下生物样本的保存通常采用4°C的储存温度，这是所分析文章中最常见的。然而，稳定性周期存在相当大的差异，从8小时到7年不等，在某些情况下，储存期未具体说明。冷藏是最低要求，但理想情况下，储存超过48小时的样本应冷冻，最好在-80°C下[57]。尽管一些文章指出，在中期和长期内，乙醇不会在4°C以上储存的样本中形成，但这并不是稳定性的唯一关注点。在室温下储存超过48小时的样本中乙醇含量降低的可能性值得注意。例如：Kosecki、Canonico和Abbott损失高达15.4%[22]；Olds损失高达16%[41]；Kosecki和Raines损失高达7.6%[43]。长期来看，即使在-20°C下储存也可能不够：Vezzoli、Bernini和De Ferrari显示30天内变化达8%[64]。
死后乙醇分析中分析前因素的重要性最近被Olds和Jones[88]强调，他们指出样本采集、保存、储存条件、死后间隔、分解程度和样本类型可能对乙醇结果的解释产生重大影响。作者还强调了替代基质、乙醇生物标志物（EtG和EtS）以及常规使用钠或钾氟化物防腐剂以最大限度地减少采样后乙醇形成的重要性[88]。
对于检测挥发性化合物（乙醛、丙酮、2-丙醇、乙酸乙酯和甲醇）和高级醇（1-丙醇、1-丁醇、异丁醇、2-甲基-1-丁醇和3-甲基-1-丁醇），条件可能更为关键。建议即使在冷冻条件下，也应在采集/尸检后24小时内进行检测[42, 49]，因为冷冻可延缓化学和微生物变化，但不能消除它们[42]。
关于样本采集量的指示也差异很大。然而，考虑到防腐剂的最终浓度、Olds和Naquin[47]描述的盐析效应（一种现象，其中盐如NaF的存在增加了化合物在水相中的溶解度，在色谱分析过程中将其置换到气相中）、将占据试管另一半的氧气体积以及样本氧化风险[41, 43, 54, 59, 61]，谨慎的做法是认为填充超过试管容量的一半[59]是一个好的建议。例如，在Tiscione等人[59]中，来自先前打开过的试管或体积小于一半的样本显示出更大的血液乙醇浓度损失（室温下5.4%至10.3年）。
从氧化风险和随之而来的乙醇损失的角度来看，建议至少双份采集样本，以便在需要重新分析或复核时，有先前未打开过的试管可用[27, 31, 41,42,43, 53, 59]。例如，在Kosecki和Raines[43]中，7年损失对于从未打开过的试管为5.2%，对于先前打开过的试管为7.6%。样本重新分析可能产生较低的乙醇浓度，因为在储存或处理过程中暴露于氧气，促进了乙醇氧化为乙醛，从而降低了血液乙醇浓度[31]。
由于氧化是乙醇浓度随时间损失的主要原因[31]，建议将样本储存在密封严密的容器中[57, 67, 75]。其他建议包括使用无菌玻璃试管盛装液体样本（如血液、尿液、VH），以避免与采集材料发生化学相互作用[57, 75]；在储存前注意样本在试管中的均匀化（轻轻倒置/短暂摇动），以便添加剂发挥作用；在运送到实验室期间保持冷藏[38]；在处理样本时使用生物安全柜[36]。
氟离子具有抗微生物活性，因此是死后毒理学中的重要防腐剂，特别是用于防止微生物乙醇新生形成。此外，NaF和KF通过抑制烯醇化酶作为抗糖酵解剂，从而减少储存期间样本的糖酵解和内源性乙醇产生[29]。在死后毒理学中，通常推荐约1-2%的NaF或KF浓度，这高于临床葡萄糖分析中常用的灰头管中的浓度。这些防腐剂可伴随抗凝剂如乙二胺四乙酸(EDTA)、柠檬酸钠或草酸钾[71]。在Ahmad等人[29]中，仅用EDTA储存的样本显示出比用NaF或草酸盐储存的样本更高的新乙醇水平，而4°C冷藏有助于样本稳定性。同样，肝素锂即使在-80°C下也无法有效保存样本[30]，这加强了氟化物盐和适当储存条件的重要性。
这些建议与Olds和Jones[88]的综述一致，他们确定向死后样本中添加1-2%（w/v）钠或钾氟化物是减少采样后运输和储存分析前乙醇生成的重要措施。Holmgren等人[89]也支持使用氟化物防腐剂，特别是当样本在分析前储存时，因为在没有氟化钾储存的玻璃体液样本中观察到显著较低的乙醇浓度。
在Phung等人[27]中，作者建议丢弃储存超过2年的样本，因为其中一些样本的乙醇损失超过了不确定度限值（9.4%），损害了结果的可靠性。然而，本研究中使用的样本在冷藏（约4°C）下储存，有些在运输或处理过程中经历了室温储存期。根据其他研究[30, 37, 39, 49, 64, 73]的结果，如果在冷冻温度（-20至-80°C）下储存，这些样本的保质期可能会长得多。
发现尸体的环境会影响尸体的保存状态，从而影响微生物新生形成。在溺亡案例中，冷水即使在长时间浸泡下也能减缓腐败[33]。然而，在酷热地区，如巴西北部，室温下储存的样本表现出强烈的乙醇新生形成趋势，特别是未用氟化物盐保存时[29]。温度是各种基质的关键因素；室温下储存的样本可能变得不适合分析[90]。Iskierka等人[32]证明，即使在NaF存在下，4°C下储存的骨髓样本也应在采集后最多两天内分析，以确保结果可靠。
一些研究质疑氟化物盐的作用。Kosecki、Canonico和Abbott[22]报道NaF不影响乙醇浓度的稳定性；然而，该研究是基于先前使用NaF的研究间接评估的。实际上，Kosecki、Canonico和Abbott[22]仅测试了无防腐剂样本；因此，无法保证变量具有可比性，并且与在不同时间、不同实验条件下获得的结果进行比较可能缺乏足够的精度。
复杂情况，如长时间浸没的尸体，需要多种基质。在Focardi等人[33]中，外周血剂量被认为是更可靠的（由于较少的死后修饰），其乙醇浓度高于心脏血中的乙醇浓度。此外，胃内容物中高浓度的乙醇表明个体在死前消耗了大量酒精。1-丙醇和异丙醇作为新生形成标志物的缺失，以及尿液中的酒精浓度低于血液中发现的浓度（表明吸收阶段，酒精仍在体内分布，尚未完全代谢或排泄），支持了这一结论，排除了死后形成的可能性。
基质的可行性至关重要，特别是在腐败案例中，分解与微生物活动直接相关，这可能通过增加污染风险来损害样本完整性，导致假阳性结果。在这种情况下，VH因其较低的污染敏感性、采集简便、最少的预处理要求、最少的分析干扰以及当关注乙醇随时间损失时比血液更高的稳定性而著称[19]。然而，应加强使用含有NaF或KF和抗凝剂的无菌、优选玻璃、密封试管，注意填充体积、采集程序、样本均匀化（轻轻倒置或短暂摇动试管）以及适当的储存温度（表3）。
最终考虑与未来展望
尸检中乙醇的检测至关重要，主要目的是将其与死因及其法律后果相关联。从这个角度来看，制定接近生物样本采集和储存最佳条件的方案旨在确保与确定乙醇含量重要性相称的安全性，从而保持证据从采集到法庭呈交的完整性和可追溯性。这一过程直接有助于证据保管链（正当程序的关键要素），从而保障充分辩护权、质疑证据的权利，以及因此更公正的审判。能够在结果之间实现更大相关性并更真实反映实际条件的方案对调查具有重要意义，并可预防或检测生物样本中乙醇水平的变化，从而确保结果的有效性和可信度。
应鼓励识别和调整实验室方案的努力，以提高流程效率、减少数据采集和储存过程中的错误、减少重复采样或重新分析的需要，并避免分析受污染的样本。将乙醇代谢物分析（如EtG和EtS）以及各种生物基质（如玻璃体液和尿液，当可用时）的分析纳入乙醇检测的常规实验室方案。尽管解释可靠性必须保持优先，但财务和基础设施限制可能影响某些法医实验室实施补充分析。对技术和标准化的投资，包括标准操作程序(SOPs)，支持可追溯性系统，有助于保持证据保管链的真实性、效率和安全性。
持续的调整，与检测乙醇及其代谢物的各种可能性保持一致，正在扩大尸检期间采集生物基质的选择。这有助于制定分析方案，将常规使用基质（如血液和尿液）中的酒精水平相关联，并加强在可用时常规使用补充基质（特别是玻璃体液）。
这些策略增加了尸检中检测的概率，并允许区分生前消耗、新生形成和乙醇氧化。此外，它们还支持对与其他毒素相关的特定标志物以及同时接触酒精和其他滥用药物所产生的化合物的保存和检测进行新的研究。
