《Plant Cell, Tissue and Organ Culture (PCTOC)》：Optimized surface decontamination of gametophores for axenic in vitro culture of the moss Warnstorfia sarmentosa (Wahlenb.) Heden?s, with application to other polar mosses
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摘要翻译：
苔藓是非维管植物，广泛分布于多种生境，并能在南极和北极等极端环境中繁茂生长。然而，目前对极地物种的遗传、代谢和分子多样性的认识仍然有限，因此需要更深入地理解其应对严酷环境的机制。在此背景下，实验室条件下的离体无菌培养是植物科学中阐明生理和生化反应的
摘要翻译：
苔藓是非维管植物，广泛分布于多种生境，并能在南极和北极等极端环境中繁茂生长。然而，目前对极地物种的遗传、代谢和分子多样性的认识仍然有限，因此需要更深入地理解其应对严酷环境的机制。在此背景下，实验室条件下的离体无菌培养是植物科学中阐明生理和生化反应的有力工具。然而，极地苔藓的离体培养具有挑战性，因为大多数物种缺乏可育孢子体或主要以不育状态存在。作为替代，可使用配子体，但许多配子体无法耐受表面消毒处理，或随后被微生物覆盖。为建立高效且可重复的消毒方法，研究人员以Warnstorfia sarmentosa (Wahlenb.) Heden?s为模式物种，比较了来自三个样点的野外采集配子体与预培养叶状枝条在不同浓度二氯异氰尿酸钠（NaDCC）和次氯酸钠（NaClO）处理下的消毒效果。来源于预培养组织的外植体总体成功率为64.1%，而野外采集材料仅为12.7%，且野外样品成功率因采集地点不同而差异显著（0–28%）。对于预培养材料，NaDCC（0.1%和0.5%）比NaClO（0.5%和1%）更有效（p?=?0.0309）。该优化方法随后被应用于其他物种。目前，来自12种极地苔藓的33个生态型已在无菌条件下成功维持，为胁迫耐受性研究、代谢物 profiling、濒危类群迁地保护及生物技术开发等应用提供了宝贵资源。
论文解读：
**研究背景与意义**
苔藓植物是陆地植物早期分化的重要类群，全球约有13,000种，广泛分布于除海水环境外的各类生态系统。极地苔藓长期适应冰冻温度、强风、低养分、短生长季和高太阳辐射等极端条件，演化出独特的代谢途径和化合物结构，具有重要的进化与生物技术研究价值。然而，目前仅有少数极地苔藓物种完成了基因组测序，其适应机制和气候响应知识的匮乏限制了相关研究。此外，极地苔藓的野外采样受生长季短、生物量有限、交通成本高昂等因素制约，难以获得充足、无污染的实验材料。离体无菌培养可在受控条件下全年提供无污染材料，是开展分子生理研究、微生物互作分析及生物技术应用的关键技术。然而，极地苔藓常因缺乏可育孢子体而只能使用配子体组织，但配子体表面消毒困难，且易被微生物污染。本研究以Warnstorfia sarmentosa为模式，旨在开发一套高效、可重复的极地苔藓配子体表面消毒方案，并将其推广至其他极地物种。
研究人员在西南极乔治王岛三个地点（巴西费拉兹司令南极站EACF、凯勒半岛巴西二号避难所REFII、阿德利岛ASPA 150）采集W. sarmentosa样本，并选取来自EACF的预培养克隆WS01作为对比材料。通过比较不同浓度二氯异氰尿酸钠（NaDCC，0.1%和0.5%）与次氯酸钠（NaClO，0.5%和1%）处理2分钟的效果，结合Fisher精确检验进行统计分析，确定了最优流程。随后将该方法应用于其他极地苔藓，并报告了适用性记录。
**主要关键技术方法**
研究使用了表面消毒剂处理（NaDCC和NaClO，浓度分别为0.1%、0.5%和0.5%、1%，处理时间2分钟），涡旋振荡辅助消毒，随后用无菌蒸馏水漂洗。外植体接种于BCD培养基，对照使用LB培养基验证无菌状态。采用预培养策略：将野外采集的配子体在非无菌条件下于BCD培养基上培养2至4周，筛选生长旺盛的克隆进行增殖。通过立体显微镜定期观察外植体发育情况，并在4周后进行成功/失败分类，成功标准为可见无污染且健康绿色组织。后续通过BCD添加蔗糖、LB和PDA培养基进行30天污染验证。此外，为筛选适合不同物种的培养基，使用了BCD、Knop和MS三种培养基进行预培养。
**研究结果**
**直接消毒野外采集配子体及再生**
对野外采集的配子体直接进行消毒，共使用212个外植体。总体成功率为12.7%（27个外植体），其中NaClO处理成功14个，NaDCC处理成功13个。不同采集点差异显著：REFII无成功外植体；EACF成功率约10%；ARD成功率最高，达到28%，其中0.5% NaDCC和0.5% NaClO处理分别获得11个和9个可见无污染外植体。多数外植体死亡或污染，且高浓度处理（1% NaClO和0.5% NaDCC）对REFII样品造成全部死亡。
**预培养配子体的消毒**
对从EACF采集的预培养克隆WS01进行相同消毒处理，共用92个外植体。总体成功率为64.1%，其中0.5% NaDCC处理成功率超过80%，1% NaClO处理成功率约40%。Fisher精确检验显示，预培养材料中NaDCC显著优于NaClO（p?=?0.0309）。预培养WS01与同来源野外EACF材料相比成功率差异极显著（p?
**继代培养与无菌系维持**
对成功消毒的外植体进行继代培养，定期（每3–4周）部分切割并转移至新鲜BCD培养基。来自ARD的一个0.5% NaDCC处理外植体被选为参考克隆。预培养WS01克隆在固体和液体BCD培养基中均能健康生长，用于生物量积累。
**优化方案在其他极地苔藓中的应用**
将预培养起始材料与NaDCC消毒相结合的方法应用于来自南极和北极的多种极地苔藓。由于该步骤旨在获得无菌培养物而非进行对照比较，未做重复设计和统计分析。通过选择预培养中生长旺盛的克隆，每个生态型选取4个配子体，分别用0.1%和0.5% NaDCC处理（每个浓度2个）。来自南极利文斯顿岛的Polytrichastrum alpinum克隆因持续污染，将NaDCC浓度提高至0.7%后获得成功。目前，已有12种极地苔藓的33个生态型成功建立无菌培养，其中7个生态型因形态学特征不足而暂定为Bryum sp.或Pohlia sp.，待分子验证。部分物种（如Hennediella antarctica、Polytrichum juniperinum和Syntrichia filaris）主要呈现原丝体生长，仍需优化培养基以促进配子体形成。
**讨论与结论**
研究表明，极地苔藓配子体的表面消毒成功率受采集地点、材料状态和消毒剂类型显著影响。野外采集材料中ARD样品成功率较高，可能与微生境及微生物群落差异有关；REFII样品所有外植体均失败，说明同一物种不同种群的耐受性存在差异。预培养可显著提高成功率，因为它选择了生长旺盛的克隆，且新产生的嫩枝对消毒剂更敏感。NaDCC比NaClO更有效，且植物毒性较低。该方案已成功应用于12种极地苔藓，证明其具有跨物种的可转移性，但需注意物种特异性调整，例如P. alpinum需要提高NaDCC浓度。研究局限包括：仅基于单一物种和单一预培养谱系；消毒时间固定为2分钟，未探讨时间与浓度的交互作用；对多物种的应用并非对照实验，仅记录适用性。
**结论**：该研究建立了一个以预培养配子体为起始材料、NaDCC为消毒剂的优化表面消毒方案，显著提高了极地苔藓离体无菌培养的成功率。该方法已成功应用于12个极地苔藓物种，获得33个无菌生态型，为极地苔藓的胁迫生理学、代谢组学、基因组测序、迁地保护及生物活性化合物筛选提供了重要的实验资源。该规程可作为极地苔藓无菌培养的可靠起点，但需根据不同物种或生态型进行针对性调整。
