枯草杆菌（Bacillus subtilis）中的一种模块化分泌平台能够实现蛋白质-谷氨酰胺转运蛋白（glutaminase）的大规模生产

《Applied Microbiology and Biotechnology》：A modular secretion platform in Bacillus subtilis enables scalable production of protein-glutamine glutaminase

　　

摘要

蛋白-谷氨酰胺谷氨酰胺酶（PGG）是一种能够提升植物蛋白功能的有望酶类，但其工业生产受到低天然产量以及需经蛋白水解活性化处理的限制。在此研究中，我们开发了一种基于Golden Gate技术的标准化模块化分泌平台，用于在枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）中筛选适宜的启动子-信号肽组合，以实现Chryseobacterium proteolyticum PGG（CpPGG）的胞外表达。通过报告基因和酶活性检测，我们确定了Pgrac100-amyQ*组合能够在枯草芽孢杆菌168菌株中实现稳定且高效的CpPGG分泌，并使分泌的前体酶在宿主细胞内完成成熟过程。在富营养基的3升批次培养体系中，该重组质粒可使上清液中的酶活性达到2.9 U/mL；然而，在高细胞密度条件下进行分批培养时，胞外蛋白水解成为生产的主要限制因素。为将分泌过程与活性化过程分离，我们将该重组质粒转入缺乏蛋白酶的KO7-S菌株中，从而成功获得了未活化的CpPGG的稳定积累。随后利用食品级中性蛋白酶进行体外活化处理后，上清液中的酶活性达到了12.8 ± 0.8 U/mL。综上所述，要在枯草芽孢杆菌中高效生产PGG，需要协同控制分泌过程、胞外稳定性以及前体酶的活性化机制。

要点

• 通过模块化筛选方法确定了适用于枯草芽孢杆菌分泌CpPGG的Pgrac100-amyQ*组合。

• 在高细胞密度条件下，枯草芽孢杆菌168菌株的分批培养过程中，胞外蛋白水解现象显著影响了产率。

• 在缺乏蛋白酶的KO7-S菌株中，分离了分泌与活化过程，最终获得12.8 ± 0.8 U/mL的上清液酶活性。