《Frontiers in Immunology》：Identification of Wnt/β-catenin- and immune-related genes in hepatic ischemia-reperfusion injury using bulk transcriptomics, single-cell RNA sequencing, and a murine model
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摘要
引言：肝缺血再灌注损伤（hepatic ischemia-reperfusion injury, HIRI）是肝移植（liver transplantation, LT）后的主要并发症，可导致移植物功能障碍和排斥反应。Wnt/β-catenin信号通
摘要
引言：肝缺血再灌注损伤（hepatic ischemia-reperfusion injury, HIRI）是肝移植（liver transplantation, LT）后的主要并发症，可导致移植物功能障碍和排斥反应。Wnt/β-catenin信号通路及免疫应答在LT相关HIRI中的作用尚未完全阐明。本研究旨在筛选与LT后HIRI中Wnt/β-catenin信号评分及免疫调控相关的关键基因。
方法：研究人员分析了三个LT相关转录组数据集（GSE151648、GSE12720和GSE189539），整合了Wnt/β-catenin通路相关基因（WRGs）和免疫相关基因（IRGs）。采用加权基因共表达网络分析（WGCNA）、差异表达分析和机器学习算法（Boruta和LASSO）鉴定核心基因。使用CIBERSORT对批量转录组数据进行反卷积分析，估算22种免疫细胞类型的相对比例。构建了关键基因表达的调控网络，包括转录因子-信使RNA（TF-mRNA）和长链非编码RNA-微小RNA-信使RNA（lncRNA-miRNA-mRNA）网络。在非移植小鼠HIRI模型中，通过qPCR、Western blot、组织学分析和血清学评估进行了初步表达水平验证。
结果：研究鉴定并验证了四个关键基因——HSP90AA1、HSP90AB1、NFATC1和THBS1。这些基因在LT后样本中显著上调，并在所分析数据集中表现出良好的区分潜力（训练集AUC > 0.9，验证集AUC > 0.7）。功能富集分析将这些基因与细胞因子活性及Jak-STAT和趋化因子信号通路等关联起来。免疫浸润分析揭示了其与M0/M2巨噬细胞及静息肥大细胞的相关性。单细胞测序描绘了其细胞类型特异性表达和分化阶段动态。在非移植小鼠HIRI模型中，四个基因的mRNA和蛋白表达水平在再灌注后6小时显著上调，与损伤高峰期一致，支持其与急性缺血再灌注损伤的关联。
结论：本研究确定HSP90AA1、HSP90AB1、NFATC1和THBS1为关键生物标志物，其表达与Wnt/β-catenin信号评分和免疫应答相关。非移植小鼠HIRI模型的结果支持这四个基因在缺血再灌注损伤急性期的上调，但其潜在的时间依赖性意义和治疗价值需在LT模型及基因功能干预实验中进一步验证。
**论文解读：肝缺血再灌注损伤中Wnt/β-catenin与免疫相关基因的整合分析**
**一、研究背景与目的**
肝移植（LT）是终末期肝病和肝源性肿瘤的标准治疗手段。然而，肝缺血再灌注损伤（HIRI）作为LT后的主要并发症，严重影响移植物功能和存活。HIRI由冷缺血和热缺血两种途径引发，作为一种由固有免疫驱动的无菌性局部炎症反应，是导致LT后早期器官功能障碍和衰竭的重要因素。供肝短缺促使边缘供体使用增加，而这些边缘供体对HIRI尤为易感。
Wnt/β-catenin信号通路在调节肝脏稳态、再生和肿瘤发生中发挥重要作用。在肝细胞癌中，该通路异常激活与不良预后及免疫抑制相关。然而，其在移植肝缺血再灌注损伤中的作用研究尚不充分。同时，免疫效应细胞激活是驱动HIRI发生发展的核心机制，但缺乏有效治疗方法。因此，筛选与Wnt/β-catenin信号及免疫调控相关的关键基因，对于理解HIRI机制和寻找治疗靶点具有重要意义。
**二、研究概述与结论**
本研究整合LT相关转录组数据和单细胞测序数据，系统筛选并鉴定了与Wnt/β-catenin信号通路和免疫应答相关的生物标志物。研究人员确立了四个关键基因：HSP90AA1、HSP90AB1、NFATC1和THBS1。这些基因在LT后样本中显著上调，具有良好区分潜力。功能富集显示其参与细胞因子活性和Jak-STAT、趋化因子等炎症相关通路。免疫浸润分析揭示其与M0/M2巨噬细胞及静息肥大细胞相关。单细胞测序确定了其细胞类型特异性表达和分化动态。非移植小鼠HIRI模型验证了四个基因在再灌注后6小时（损伤高峰期）mRNA和蛋白水平的显著上调。该研究为理解LT相关HIRI的分子机制提供了新见解，并提出了潜在的治疗靶点和生物标志物，但其功能作用和治疗价值需在LT模型和基因干预实验中进一步验证。论文发表在《Frontiers in Immunology》。
**三、主要关键技术方法**
研究人员采用多组学整合策略：利用三个LT相关转录组数据集（GSE151648为训练集，GSE12720为验证集，GSE189539为单细胞数据集），整合Wnt/β-catenin通路相关基因和ImmPort免疫相关基因；通过加权基因共表达网络分析（WGCNA）鉴定WRG评分相关模块，结合差异表达分析和两种机器学习算法（Boruta和LASSO）筛选候选基因；使用CIBERSORT反卷积分析22种免疫细胞比例；构建TF-mRNA和lncRNA-miRNA-mRNA调控网络；对单细胞数据进行聚类、注释和拟时序分析；最终在非移植小鼠HIRI模型（70%肝脏缺血1小时）中通过qPCR和Western blot验证关键基因表达。
**四、研究结果**
**1. WRG评分相关模块、候选基因筛选及四个关键基因的鉴定**
训练集分析显示，LT后样本的WRG评分显著升高。WGCNA鉴定出与WRG评分显著相关的蓝色模块（r = -0.34）和蓝绿色模块（r = 0.32），共包含7,184个模块基因。差异表达分析获得926个DEGs（862个上调，66个下调）。三者取交集获得50个候选基因。功能富集显示这些基因富集于细胞因子-细胞因子受体相互作用等通路。经Boruta和LASSO两种算法筛选并取交集，最终确定四个在训练集和验证集中均显著上调且AUC值达标的关键基因：HSP90AA1、HSP90AB1、NFATC1和THBS1。
**2. 四个关键基因的初步验证与功能特征分析**
反向传播（BP）神经网络模型验证显示预测值与实际值相关性为0.9156，误差为0.04，验证性能良好。GeneMANIA分析显示四个基因主要与Fc受体信号通路、端粒酶活性调控等相关。单基因GSEA富集分析表明，四个关键基因均富集于“细胞因子活性”，部分基因富集于“白细胞趋化”、“对白细胞介素-1的应答”以及Jak-STAT、MAPK、趋化因子信号通路。
**3. 关键基因的免疫相关性与调控网络分析**
CIBERSORT分析显示LT后9种免疫细胞类型显著改变。相关分析表明，M0巨噬细胞与四个关键基因显著正相关，而M2巨噬细胞和静息肥大细胞与关键基因显著负相关。调控网络分析预测了10个转录因子、70个miRNA和39个lncRNA。TF-mRNA网络显示TP53可能调控HSP90AB1和THBS1。lncRNA-miRNA-mRNA网络包含如hsa-miR-222-3p-GAS5-THBS1、hsa-miR-124-3p-DLEU1-NFATC1等调控轴。
**4. 单细胞RNA测序分析揭示HIRI细胞景观及关键基因细胞类型特征**
单细胞数据集经过严格质控保留55,901个细胞，聚类注释出11种细胞类型：T/NK细胞、内皮细胞、中性粒细胞、单核细胞、巨噬细胞、B细胞、造血干细胞、浆细胞、肝细胞、祖细胞和肥大细胞。细胞通讯分析鉴定出26种配体-受体及多聚体相互作用。关键基因定位分析显示，HSP90AA1和HSP90AB1在多种细胞类型中表达，NFATC1主要在B细胞中高表达，THBS1在巨噬细胞和造血干细胞中高表达。拟时序分析显示THBS1在分化前阶段高表达，而HSP90AB1在分化后期高表达。四个关键基因均与Wnt信号通路评分显著正相关。
**5. 关键基因在肝缺血再灌注损伤模型中的实验验证**
非移植小鼠HIRI模型验证结果显示：H&E染色可见再灌注6-12小时肝细胞坏死和微循环障碍；TUNEL染色显示凋亡细胞从中央区向周边扩散；血清ALT和AST水平持续升高；TUNEL阳性细胞数和凋亡率在再灌注后6小时达到峰值。qPCR结果显示四个基因在再灌注6小时均显著上调并达到表达峰值。Western blot结果与qPCR一致，四个基因蛋白水平在6小时达峰，12小时开始下降。
**五、讨论与结论**
本研究整合转录组和单细胞数据，鉴定出四个与LT相关HIRI密切相关的关键基因。HSP90AB1和HSP90AA1作为分子伴侣，可能通过调控客户蛋白折叠参与损伤修复，其与Wnt共受体LRP5的相互作用提示与Wnt信号存在潜在联系。NFATC1作为NFAT转录复合物成分，是免疫抑制药物靶点，其泛素化调控可能参与HIRI过程。THBS1作为血小板聚集和血管生成的调节因子，其与CD47的相互作用与免疫调控有关，并可能参与肝脏病理挑战后的适应性过程。
免疫浸润分析揭示了关键基因与M0/M2巨噬细胞及肥大细胞的相关性，提示巨噬细胞介导的炎症反应在HIRI中的核心作用。单细胞分析提供了关键基因的细胞来源信息，如HSP90家族在内皮细胞中的表达可能与微循环障碍相关，THBS1在巨噬细胞和造血干细胞中的高表达可能涉及炎症和组织重塑。
研究结论：通过整合生物信息学分析和非移植小鼠HIRI模型的表达验证，研究人员确定HSP90AA1、HSP90AB1、NFATC1和THBS1为与LT相关HIRI相关的关键基因，并观察到它们在缺血再灌注损伤急性期的上调。其阶段特异性表达特征及与Wnt/β-catenin通路评分和免疫应答的相关性，为理解HIRI相关转录改变提供了线索。小鼠HIRI模型结果主要支持这些基因在缺血再灌注损伤中的表达变化，但未直接验证其在LT相关HIRI中的功能作用。未来需在LT模型中开展条件性敲除、药理学抑制或通路干预实验，以进一步阐明其因果作用和治疗价值。
