单细胞转录组学揭示(R)-尼古丁/香叶木素组合与加兰他敏在LPS刺激的BV2细胞中关联的不同小胶质细胞状态重塑

《Frontiers in Immunology》：Single-cell transcriptomics reveals distinct microglial state remodeling associated with the (R)-nicotine/diosmetin combination and galantamine in LPS-challenged BV2 cells

　　

背景：小胶质细胞神经炎症促进神经退行性疾病进展，但在保留细胞功能的同时减轻炎症反应仍具挑战。(R)-尼古丁、香叶木素、两者联合（DR）及加兰他敏对异质性BV2转录状态的影响尚未在单细胞分辨率下比较。方法：LPS刺激的BV2小胶质样细胞分别用(R)-尼古丁、香叶木素、DR或加兰他敏处理。进行单细胞RNA测序（scRNA-seq），每组三个生物学重复，并整合RNA速率（RNA velocity）与SCENIC调节子推断，以表征治疗关联的状态再分布、推断的局部转录方向性及调节子活性模式。功能验证包括CCK-8代谢活性检测、多重细胞因子酶联免疫吸附试验（ELISA）、BDNF/GDNF定量、qPCR及iNOS和Arg1单细胞分辨率高内涵免疫荧光分析。结果：LPS降低了Itgae+/Plk4+簇的相对丰度，增加了Nmur1+/Limk2+簇及炎症效应程序。DR处理抑制促炎细胞因子释放且不显著降低CCK-8评估的代谢活性，增加Itgae+/Plk4+簇比例，并相对于LPS增加BDNF/GDNF。RNA速率与SCENIC分析提示DR与加兰他敏呈现不同转录与调控模式：DR减弱Batf关联炎症调节子并伴随Atf3关联应激反应活性增加，而加兰他敏优先参与DNA修复与基因组维持程序。结论：这些发现表明DR条件关联于LPS刺激的BV2小胶质样状态重塑、炎症程序减弱及相对于LPS神经营养输出增加，且不显著降低CCK-8评估的代谢活性。本研究为(R)-尼古丁、香叶木素、其联合及加兰他敏的治疗关联响应提供了单细胞表征。

研究背景与立题依据：小胶质细胞作为中枢神经系统（CNS）常驻巨噬细胞，承担免疫监视、突触修剪与组织修复等稳态功能；其过度持续激活会驱动阿尔茨海默病（AD）、帕金森病（PD）等多发神经退行进程。脂多糖（LPS）急性刺激模型可稳定复现小胶质高激活、免疫代谢偏移与促炎介质释放等核心机制，但传统M1/M2二分法已被单细胞转录组学修正为连续功能态谱。当前神经炎症干预的核心难点，是既能衰减炎症程序又不广泛牺牲小胶质细胞功能。（R）-尼古丁作为尼古丁立体异构体、香叶木素（diosmetin）作为黄酮类天然产物，分别被报道可经α7烟碱型乙酰胆碱受体（α7nAChR）正变构或Nrf2–Keap1/NF-κB/NLRP3通路发挥作用；加兰他敏（galantamine）亦被视作药理对照。上述化合物的受体机制在BV2模型中并不自带结论，因此研究人员设计了一项比较性治疗响应分析，而非协同性或α7nAChR依赖性检验，旨在以单细胞分辨率刻画LPS挑战下各药的状态重分布与调节子逻辑。该研究发表于《Frontiers in Immunology》。

主要关键技术方法：研究人员采用LPS（1 μg/mL）刺激BV2小鼠小胶质样细胞系，设对照、LPS单激、加兰他敏（10 μM）、香叶木素（10/25 μM）、(R)-尼古丁（10 μM）及DR（10 μM+10 μM）组，每组三个生物学重复；部分实验增设DR+甲基牛扁碱（MLA）拮抗对照。核心方法包括：SeekOne? DD单细胞3′建库与Illumina NovaSeq X Plus测序，Seurat流程下SCTransform归一、无额外批次校正聚类出9个标记定义态；scVelo动态模型推算RNA速率；pySCENIC（GRNBoost2+cisTarget+AUCell）推断转录因子调节子；功能端用CCK-8测代谢活性、小鼠多重ELISA定量IL-6/IL-1β/TNF-α/MCP-1/IL-17/BDNF/GDNF、高内涵免疫荧光定iNOS与Arg1单细胞质、qPCR校验Batf/Atf3/Cd80/Cd86/Cd68/Cd163及Il1b/Il6/Tnf；统计以生物学重复（n=3）为推断单元，普通单因素ANOVA+Tukey校检，单细胞分布仅作描述。

研究结果

3.1 单细胞图谱揭示药物特异性状态偏移：无监督聚类得到9个转录态，LPS使Itgae⁺/Plk4⁺态比例下降、Nmur1⁺/Limk2⁺态上升；DR部分逆转该偏移，提升Itgae⁺/Plk4⁺并压低Nmur1⁺/Limk2⁺相对丰度，炎症效应簇（Saa3⁺、Cxcl2⁺）收缩有限，证明治疗关联重构沿Nmur1⁺/Limk2⁺–Itgae⁺/Plk4⁺轴发生。

3.2 分泌因子支持免疫调节且不降代谢活性：CCK-8信号各药均不显著低于对照90%；LPS拔高IL-6/IL-1β/TNF-α/MCP-1/IL-17，DR对IL-17与MCP-1抑制强于单药；炎症模块评分（Ccl4/Nfkbia/Ccl2/Ccl7）在DR下分布左移，说明联合既抑单因子也抑协调炎症程序。

3.3 表型验证与RNA速率映射治疗关联转录模式：高内涵IF示LPS促iNOS累积，DR最显著降压；qPCR示Cd80/Cd86被DR下调。RNA速率上，LPS矢量指向Cxcl2⁺/Saa3⁺炎症区；DR/DIO矢量更多转向Itgae⁺/Plk4⁺区并伴Il1rn/Dusp5/Ppp1r15a/Bag3/Hspa8等反馈修复程序；加兰他敏矢量独走Neil3/Fancd2/Mcm6/Prc1等DNA维护修复区，确立“反馈应激适应（DR）”与“基因组维持（GAL）”两条异轨。

3.4 治疗关联标记变化伴不同TF调节子活性：IF示Arg1被LPS压低、DR回升；SCENIC中LPS抑Junb/Fos/Atf3/Klf6/Odc1而拔高Batf/Bhlhe40/Mybl2，DR降Batf调节子、升Atf3/Nfe2l1/Ddit3关联应激缓冲程序，qPCR复述Batf mRNA降、Atf3 mRNA升，形成Batf–Atf3反向配对这一候选转录模式。

3.5 神经营养态富集关联BDNF/GDNF恢复：ELISA示LPS抑BDNF/GDNF、DR rescue；单细胞神经营养评分（Bdnf/Gdnf/Ngf/Ntf3/Igf1/Fgf2）呈右偏长尾，固定阈>0.05或样本内三组分高斯混合（GMM）均示DR上尾细胞比例高于LPS；共表达网中Igf1桥接炎症（Nos2/Tnf）与营养（Bdnf/Arg1）模块，Atf3/Jun/Igf1为营养态富集关联节点。

讨论与结论翻译：研究人员讨论中指出，DR关联于LPS刺激BV2小胶质样态重塑、炎症程序衰减与部分神经营养输出恢复，而非广谱免疫抑制；Itgae⁺/Plk4⁺与Nmur1⁺/Limk2⁺仅为BV2标记态，不等同体内人小胶质亚型；RNA速率仅为横截面单时点推断方向，非细胞实移证据；加兰他敏走基因组维护轨、DR走反馈应激适应轨，二者皆未证成免疫耐受或主动炎症消退；Batf–Atf3模式与Igf1桥接网属计算推断，缺TF扰动/ATAC/ChIP验证；MLA未取消DR的Il1b/Il6/Tnf表达格局，故α7nAChR依赖性不成立。结论原文意译：上述发现表明DR条件关联于LPS挑战BV2小胶质样状态重塑、炎症程序衰减及相对于LPS神经营养输出增加，且不显著减低CCK-8评估的代谢活性；本研究为(R)-尼古丁、香叶木素、其联合及加兰他敏的治疗关联差异响应提供了单细胞尺度表征。