群体感应基因abaI增强鲍曼不动杆菌荚膜产生及致病性

《Frontiers in Microbiology》：Quorum sensing gene abaI enhancing capsule production and pathogenicity of Acinetobacter baumannii

　　

摘要
引言：鲍曼不动杆菌（Acinetobacter baumannii, A. baumannii）是一种革兰阴性球杆菌，可引起多种感染性疾病。群体感应（Quorum Sensing, QS）系统是细菌中广泛存在的一种调控群体行为的机制，在多种革兰阴性病原菌的毒力调控中发挥关键作用。本研究旨在探讨鲍曼不动杆菌群体感应系统对荚膜产生及致病性的影响。
方法：本研究以一株临床分离的碳青霉烯耐药黏液型鲍曼不动杆菌（CRAB110）为研究对象，利用CRISPR/Cas9系统构建了abaI基因敲除株（CRAB110ΔabaI）。随后，通过评估细菌表型、生理特性、基因表达及对宿主的影响，评价荚膜产生、细菌毒力及宿主免疫应答的变化。
结果：结果表明，与CRAB110相比，CRAB110ΔabaI的荚膜产生、毒力和免疫应答均受到显著影响。与感染CRAB110的小鼠相比，感染CRAB110ΔabaI的小鼠炎症反应减轻。对CRAB110和CRAB110ΔabaI的转录组比较分析，鉴定出与多糖合成（wza、wzb、wzc）、半乳糖代谢（GalM）、ABC转运及氨基酸代谢相关的差异表达基因。小鼠肺部转录组及细胞Western blot数据表明，群体感应（QS）通过影响IL-17和NF-κB通路，发挥其经由鲍曼不动杆菌介导的促炎效应。
结论：本研究表明，abaI基因可增强鲍曼不动杆菌的荚膜产生及致病性，为临床耐药鲍曼不动杆菌感染的防治提供了新见解，也为新型抗菌药物的研发奠定了基础。

论文解读：群体感应基因abaI对鲍曼不动杆菌荚膜产生与致病性的调控机制研究

一、研究背景与科学问题

鲍曼不动杆菌（Acinetobacter baumannii）是一种非发酵、严格需氧的革兰阴性球杆菌，广泛分布于自然环境中。流行病学调查已明确其可导致呼吸机相关性肺炎（VAP）、血流感染及尿路感染等多种感染性疾病。其中，鲍曼不动杆菌引起的VAP是最常见的医院获得性感染，主要影响需要机械通气的重症监护室（ICU）患者。临床数据显示，此类VAP的病死率高达40%至70%。碳青霉烯类抗生素因其广谱活性及强效杀菌作用，长期以来是多重耐药鲍曼不动杆菌感染的一线治疗药物。然而，该类药物的过度使用已导致鲍曼不动杆菌出现严重的耐药性，碳青霉烯耐药鲍曼不动杆菌（CRAB）感染所致的高病死率使得阐明其宿主感染机制至关重要。

鲍曼不动杆菌传统上被视为低毒力病原体，但越来越多的研究已鉴定出多种与其致病性相关的毒力因子，包括青霉素结合蛋白（PBPs）、外膜蛋白OmpA、脂多糖（LPS）、荚膜多糖（CPS）、磷脂酶、外膜囊泡（OMVs）及蛋白分泌系统等。这些因子在宿主免疫监视逃逸、宿主细胞黏附、内化及凋亡诱导等不同发病阶段发挥适应性优势。值得注意的是，临床实验室中经常分离到黏液型鲍曼不动杆菌菌落，此类菌株被认为具有更强的毒力，且该表型与荚膜厚度密切相关。

群体感应（QS）系统是细菌中普遍存在的调控机制，通过感知群体密度来调节群体行为，在调控细菌毒力方面发挥关键作用。鲍曼不动杆菌的QS系统主要由信号分子合酶基因abaI、转录调控因子AbaR及酰基高丝氨酸内酯（AHL）信号分子组成。既往QS研究多采用标准菌株，聚焦于生物被膜形成和细菌运动性等毒力表型。随着临床CRAB及黏液型菌株流行率不断上升，QS已成为重要的临床挑战。因此，本研究利用CRISPR/Cas9技术，以临床黏液型CRAB菌株CRAB110为亲本构建abaI基因敲除株，系统研究abaI对鲍曼不动杆菌荚膜产生、毒力及宿主免疫应答的影响。

二、主要关键技术方法

研究人员从贵州医科大学附属医院收集的临床分离株CRAB110（碳青霉烯耐药黏液型鲍曼不动杆菌）出发，利用CRISPR/Cas9系统构建abaI基因敲除株CRAB110ΔabaI。研究采用KYC55生物传感器菌株检测长链AHL信号分子产生；通过黏液丝试验、刚果红荚膜染色及厚度测量、荚膜多糖提取定量、密度梯度离心等技术评估荚膜表型；采用高效阴离子交换色谱（HPAEC）分析单糖组成。动物实验选用SPF级雌性BALB/c小鼠，通过气管插管注射建立肺部感染模型，评估生存率、肺组织病理、肺水肿及血清细胞因子水平。体外实验采用A549和BEAS-2B肺上皮细胞进行黏附试验，RAW264.7巨噬细胞进行吞噬试验，Western blot检测IL-17和NF-κB通路蛋白表达。此外，对细菌及感染小鼠肺组织进行转录组测序分析，并通过qRT-PCR验证。

三、研究结果

3.1 abaI基因敲除对毒力相关表型的影响

CRAB110ΔabaI成功构建后，生长曲线测定显示敲除株在对数期的生长速度快于野生株。表面运动性试验表明，敲除株的运动能力较野生株显著降低。信号分子检测中，野生株CRAB110与KYC55传感器菌株产生颜色反应，而敲除株无颜色反应，证实abaI基因敲除影响了长链信号分子的分泌。黏液丝试验显示野生株CRAB110呈阳性，黏液丝长度可达4 cm，而敲除株呈阴性；菌落表型观察发现野生株光滑湿润，敲除株粗糙干燥。这些结果表明abaI基因影响细菌的黏液产生。

3.2 abaI基因敲除削弱菌株荚膜产生能力

荚膜染色实验显示野生株CRAB110荚膜较厚，而敲除株荚膜厚度显著减小。荚膜多糖粗提取定量结果显示，CRAB110多糖浓度为77.24 μg/mL，而CRAB110ΔabaI仅为11.85 μg/mL。密度梯度离心实验证实CRAB110在分离介质中位于较高位置，而敲除株位于较低水平，表明野生株荚膜更强。单糖组成分析发现，abaI基因敲除后半乳糖、葡萄糖醛酸等组分显著降低，而葡萄糖和核糖含量升高。综合结果表明，abaI基因缺失显著降低了菌株的荚膜产生能力。

3.3 abaI基因敲除减弱菌株致病性

小鼠肺部感染模型中，野生株CRAB110感染组小鼠在48小时开始死亡，72小时内共死亡5只，而敲除株感染组在整个7天观察期内无死亡。肺组织病理学检查显示，CRAB110感染组在48小时出现明显的肺泡上皮坏死、胞质溶解、核固缩及细胞脱落，伴有间质淋巴细胞和中性粒细胞浸润；而敲除株感染组的炎症水平较24小时有所下降。肺水肿指数测定表明，敲除株感染组在24和48小时的肺水肿程度显著低于野生株感染组。血清细胞因子检测显示，敲除株感染组TNF-α和IL-6水平显著低于野生株感染组。趋化因子检测发现，CRAB110ΔabaI感染组小鼠的CCL20、CXCL5和CCL24表达水平呈现低于野生株感染组的趋势。细胞实验表明，敲除株对A549和BEAS-2B上皮细胞的黏附能力及被RAW264.7巨噬细胞吞噬的数量均显著高于野生株。Western blot结果显示，CRAB110感染A549细胞后IL-17和NF-κB p65蛋白水平显著升高，而敲除株感染组的IL-17和p65蛋白水平较野生株显著降低。

3.4 abaI基因敲除后毒力降低的分子机制

细菌转录组分析显示，CRAB110和CRAB110ΔabaI共表达基因2230个，筛选出差异表达基因（DEGs）1772个，其中984个上调、788个下调。GO和KEGG富集分析表明，差异基因主要富集在氨基酰-tRNA生物合成、核糖体、糖酵解/糖异生、硫代谢、磷酸戊糖途径及脂多糖生物合成等通路。关键发现是wzy多糖合成途径的wza、wzb、wzc三个基因在敲除株中显著下调，参与D-半乳糖代谢的关键基因galM显著上调，而CPS合成相关基因galU显著下调。此外，与毒力相关的氨基葡萄糖磷酸化酶GlmM、Zeta家族蛋白及转录调控因子BetI等基因在敲除株中也显著下调。

小鼠肺组织转录组分析显示，与CRAB110感染组相比，CRAB110ΔabaI感染组有1140个基因显著上调和1534个基因显著下调。KEGG富集分析发现，细胞因子-细胞因子受体互作通路富集的差异基因最多，且大部分下调；与炎症相关的IL-17、HIF-1、NF-κB、C型凝集素受体、肿瘤坏死因子、MAPK及Toll样受体信号通路中，大多数基因在CRAB110ΔabaI组呈下调趋势。筛选共表达转录组中与免疫和感染相关的显著通路基因，发现Csf3、Slc39a14、CXCL3等与固有免疫应答、免疫细胞分化和迁移相关，多种白细胞介素（IL6、IL10、IL-1α、IL-1β、IL-17A、IL-17F）、趋化因子（CXCL1、CXCL2、CXCL3、CCL4、CCL24）及TNF、TNFAIP3等炎症相关基因在敲除株感染组中虽然较生理盐水组显著上调，但上调程度低于野生株感染组。

免疫细胞浸润分析显示，CRAB110ΔabaI感染小鼠的M1巨噬细胞和中性粒细胞数量高于野生株感染组，而野生株感染组的活化肥大细胞数量多于敲除株感染组。这些结果表明M1巨噬细胞、肥大细胞和中性粒细胞的协同作用有助于宿主更有效地清除CRAB110ΔabaI感染。

四、讨论与结论

讨论部分指出，鲍曼不动杆菌的黏液菌落表型能赋予菌株抵抗干燥和吞噬的能力，其黏液主要成分为荚膜多糖。本研究发现abaI基因敲除后信号分子分泌受阻、荚膜产生显著减弱、毒力明显降低。在革兰阴性菌中，CPS形成主要与Wzy多糖合成途径相关，其中wza-wzb-wzc复合体发挥关键作用：Wza为外膜蛋白负责将荚膜多糖从周质空间转运至细菌表面，Wzb作为磷酸酶通过调控Wzc的磷酸化状态来控制荚膜多糖的聚合程度和产量。敲除株转录组中wza、wzb、wzc及galU基因显著下调，而galM基因显著上调，提示abaI基因敲除增强半乳糖分解代谢、减少细菌半乳糖含量，从而降低菌株黏稠度和毒力。趋化因子家族在白细胞募集至炎症部位过程中发挥核心作用，CRAB110ΔabaI感染小鼠中CCL20、CXCL5和CCL24表达下调，表明其诱导的宿主炎症反应弱于野生株。IL-17A和IL-17F可诱导IL-6、TNF-α及CC和CXC亚家族趋化因子的分泌，在急性肺损伤中NF-κB信号通路被公认为核心调控者。与CRAB110感染组相比，CRAB110ΔabaI感染组中IL-17和NF-κB信号通路的促炎因子均下调，证实这两条通路是鲍曼不动杆菌感染的关键炎症通路。

研究结论：本研究表明，abaI基因促进信号分子AHL产生，在野生株CRAB110中上调荚膜形成相关基因（wza、wzb、wzc）并下调半乳糖代谢相关基因，从而促进黏液表型形成。在小鼠肺部感染模型中，CRAB110感染升高促炎细胞因子和趋化因子水平，激活IL-17和NF-κB信号通路，导致严重炎症和小鼠死亡。abaI基因敲除（CRAB110ΔabaI）导致黏液表型减弱和毒力下降，感染后宿主炎症反应减轻、巨噬细胞募集增强，小鼠得以存活。这些发现表明abaI基因在调控鲍曼不动杆菌荚膜产生和毒力中发挥重要作用，可能成为新型抗菌策略的潜在靶点。该研究为临床耐药鲍曼不动杆菌感染的防治提供了新的理论依据，相关研究成果发表于《Frontiers in Microbiology》。