双歧杆菌菌株对人乳低聚糖和乳糖的代谢互作与生长动态

《Frontiers in Microbiology》：Metabolic interactions and growth dynamics of Bifidobacterium strains in response to human milk oligosaccharides and lactose

　　

双歧杆菌是婴儿肠道菌群的主要代表，通常被认为是健康母乳喂养婴儿的特征标志。其定植由碳水化合物（即人乳低聚糖（HMOs））驱动。婴儿肠道菌群利用HMO产生的代谢产物，如短链脂肪酸和乳酸，与宿主健康益处相关。本研究以婴儿典型双歧杆菌菌株长双歧杆菌婴儿亚种（Bifidobacterium longum subsp. infantis）、短双歧杆菌（B. breve）和两歧双歧杆菌（B. bifidum）为对象，研究其单一培养及共培养时的生长和酸性代谢产物。将HMO 2’-岩藻糖基乳糖（2’-FL）和6’-唾液酸基乳糖（6’-SL）作为碳水化合物底物，单独、联合或与乳糖混合使用，并与单独乳糖和葡萄糖作为培养基中标准碳水化合物补充剂进行比较。单一培养和共培养的细菌生长在生长曲线和36 h光密度上表现出随碳水化合物而异的差异。在补充等摩尔2’-FL和乳糖的培养基中，所有单一培养和共培养的双歧杆菌菌株达到最佳生长，并通过高效液相色谱（HPLC）分析检测到高浓度有机酸。补充6’-SL时，两歧双歧杆菌是唯一能在单一培养中生长的菌株；然而在共培养中，其存在影响了混合培养的生长曲线，尽管36 h后其自身细胞比例经定量PCR（qPCR）测定仍低至估计占所有双歧杆菌细胞的10%。细菌代谢产物的产生在6’-SL及与2’-FL联合时比其他任何碳水化合物底物更为复杂。这些结果表明，单一菌株培养在特定HMO底物上的生长不能预测混合菌株培养中有机酸的潜在产生。多种双歧杆菌菌株的互作及其在特定底物组成下的交叉喂养特性可能影响对婴儿及后期生命至关重要的关键代谢产物的产生。

论文解读：双歧杆菌在人乳低聚糖和乳糖条件下的代谢互作与生长动态

**研究背景与意义**

双歧杆菌属是婴儿肠道菌群中的主要成员，在健康母乳喂养婴儿肠道内可占全部细菌的60%–70%。人乳中富含乳糖（65–70 g/L）及种类繁多的人乳低聚糖（human milk oligosaccharides，HMOs），浓度约为5–20 g/L。HMOs无法被宿主消化酶降解，可完整到达下消化道，作为双歧杆菌等肠道微生物的碳源。HMO的结构以乳糖为核心，可被岩藻糖基化或唾液酸基化，其中2’-岩藻糖基乳糖（2’-fucosyllactose，2’-FL）和6’-唾液酸基乳糖（6’-sialyllactose，6’-SL）是含量最丰富的小分子HMO。不同双歧杆菌菌株利用HMO的策略存在差异：长双歧杆菌婴儿亚种（Bifidobacterium longum subsp. infantis）通过胞内转运体和酶系完整摄取并代谢HMO；短双歧杆菌（B. breve）仅能利用特定HMO类型或其裂解产物；两歧双歧杆菌（B. bifidum）则依靠胞外锚定的糖苷水解酶切割HMO的糖苷键，释放单糖或寡糖供自身及其他菌株利用。这种胞外裂解机制可促进菌群间的交叉喂养（cross-feeding）。

尽管单一双歧杆菌菌株的HMO代谢途径已有较深入研究，但在多种碳水化合物底物共存条件下多种菌株间的相互作用仍不清楚。既往研究多采用粪便样本或单/双菌株体外培养，且常仅在属水平鉴定双歧杆菌，忽略种间代谢差异及其在复杂菌群中的互作效应。因此，本研究旨在通过受控体外实验，比较婴儿肠道中三种代表性双歧杆菌菌株在单培养和共培养条件下、以不同碳水化合物及其组合为底物时的生长动态和有机酸产生模式，探究菌株互作对代谢产物输出的影响，为益生菌和合生元制剂的科学设计提供依据。该论文发表于《Frontiers in Microbiology》。

**主要技术方法**

研究人员从日本微生物菌种保藏中心（JCM）获得两歧双歧杆菌JCM 7004、两歧双歧杆菌JCM 1254和短双歧杆菌JCM 7019，从德国微生物菌种保藏中心（DSMZ）获得长双歧杆菌婴儿亚种DSM 20088。采用DSMZ medium 58进行厌氧培养，以2’-FL、6’-SL、乳糖、葡萄糖及不同组合作为碳水化合物底物。实验涉及单菌株和各菌株组合的共培养，初始接种细胞数通过实时荧光定量PCR（qPCR）结合光密度（OD）标准曲线进行精确调整。培养36 h后测定OD和pH值，利用高效离子交换色谱（HPLC）分析培养上清液中有机酸（乳酸、乙酸、丙酸、丁酸、甲酸等）的浓度，并用qPCR定量各菌株在共培养体系中的细胞比例。

**研究结果**

**3.1 双歧杆菌菌株在不同碳水化合物底物中的生长**
在单培养实验中，长双歧杆菌婴儿亚种和短双歧杆菌在以葡萄糖（5 mM）和2’-FL/乳糖（10 mM）为底物时获得最高的OD值，且显著高于其他底物（p = 0.014）；以乳糖为底物时，两种菌的生长在12 h后即停滞。6’-SL单独不能支持长双歧杆菌婴儿亚种的生长，其生长曲线与无额外碳水化合物的对照相似。两歧双歧杆菌两个菌株在所有底物下的OD值均低于其他两种菌，其中婴儿来源的JCM 7004在6’-SL（5 mM）下获得最高OD，而成体来源的JCM 1254则在2’-FL/乳糖（10 mM）、6’-SL（5 mM）及乳糖（5 mM）下生长最佳。在双菌共培养中，长双歧杆菌婴儿亚种与短双歧杆菌的混合培养在以2’-FL/乳糖（10 mM）和乳糖（5 mM）为底物时生长最快，短双歧杆菌在葡萄糖和乳糖条件下明显占据细胞数量优势；但在单HMO或2’-FL/乳糖条件下二者比例较为均衡。在含两歧双歧杆菌的所有共培养组合中，2’-FL/乳糖（10 mM）均诱导最高OD和最快生长速率；长双歧杆菌婴儿亚种在与两歧双歧杆菌共培养后始终占优势，短双歧杆菌与两歧双歧杆菌共培养时两菌比例约为9:1。三菌共培养时，2’-FL/乳糖和2’-FL/6’-SL（10 mM）产生最高OD，两歧双歧杆菌在所有底物下均为最少菌株。值得注意的是，在6’-SL培养基中，尽管两歧双歧杆菌是唯一能在单培养中利用该底物的菌株，其在共培养中却被长双歧杆菌婴儿亚种（约占85%）或短双歧杆菌（约占95%）竞争淘汰，在三菌混合体系中仅占总菌数的约5%。

**3.2 碳水化合物补充对培养基pH的影响**
培养36 h后的pH值与OD值总体呈负相关。两歧双歧杆菌虽然OD值低于其他菌株，但在所有碳水化合物补充条件下均能将pH降至5.00以下，显示出高效的产酸能力。2’-FL/乳糖补充使所有菌株培养基均达到低pH值；在2’-FL/6’-SL补充条件下，仅短双歧杆菌单培养未能达到同等酸化程度。

**3.4 有机酸产生与生长关系**
培养基中总有机酸产量与细菌生长总体相关，但两歧双歧杆菌单培养的生长密度（OD）不能预测其总有机酸浓度。在含两歧双歧杆菌的共培养中，总有机酸产量与OD相关，但该菌自身细胞数（qPCR测定）与总有机酸无关。以葡萄糖为底物时总有机酸产量最高（可达80 mM以上），乳糖次之（约60 mM），但三菌混合培养中乳糖促进了更高有机酸产生。在HMO底物中，长双歧杆菌婴儿亚种可利用2’-FL产生约50 mM有机酸，而短双歧杆菌几乎不生长；6’-SL仅支持两歧双歧杆菌生长，单培养时总有机酸从32.1 ± 3.2 mM显著增加至50.2 ± 1.9 mM（p = 0.014）。在共培养中，原本不能在6’-SL中生长的菌株细胞数反而增加并超过两歧双歧杆菌，同时有机酸产量保持高水平。2’-FL/6’-SL（10 mM）产生的有机酸总量（60.3 ± 3.4 mM）高于2’-FL/乳糖（48.1 ± 2.1 mM）。无碳水化合物补充时，所有培养的OD和有机酸产量均最低。

**3.5 单一有机酸的产生**
在所有培养上清液中均检测到乳酸、乙酸和甲酸；戊酸、异戊酸和丙酮酸仅痕量检出。无底物对照中，长双歧杆菌婴儿亚种产生约5 mM乳酸、15 mM乙酸和1 mM甲酸，表明培养基中氨基酸等成分的微弱发酵贡献。葡萄糖补充时乙酸产量最高可达约60 mM，乳酸约30 mM。2’-FL作为唯一底物时，长双歧杆菌婴儿亚种产生最高的乙酸浓度（38.6 ± 0.7 mM），而短双歧杆菌几乎不产酸。6’-SL补充时，仅两歧双歧杆菌菌株高效利用该底物，产生约40 mM乙酸和高达20 mM乳酸；共培养中两歧双歧杆菌仍产生等量乙酸但乳酸浓度降低，同时长双歧杆菌婴儿亚种和短双歧杆菌的培养基中出现一种保留时间与异丁酸一致的化合物，共培养时浓度约10 mM。在2’-FL/6’-SL（5 mM）下，除短双歧杆菌外所有培养均产生约40 mM乙酸；浓度提高至10 mM时，共培养中有机酸产量进一步提高，两歧双歧杆菌的乳酸产量显著上升。2’-FL/乳糖（10 mM）条件下，各菌株乳酸产量介于2–20 mM之间，乙酸产量均约为40 mM。乳酸/乙酸比值方面，长双歧杆菌婴儿亚种和两歧双歧杆菌在乳糖存在时比值约为1–2，两歧双歧杆菌在6’-SL下亦如此；短双歧杆菌仅在以葡萄糖或乳糖为单一底物时产生较高比值；共培养中比值普遍较低，乙酸占主导。

**总结与讨论**

研究人员通过受控的单一和混合菌株培养体系证明，婴儿相关双歧杆菌在HMOs和乳糖或单糖上的生长表现并不能可靠预测其发酵代谢产物的产量和谱型。菌株间的交叉喂养互作可使低丰度菌株——特别是两歧双歧杆菌——对短链脂肪酸（SCFA）和乳酸的产生发挥不成比例的巨大影响。两歧双歧杆菌凭借其胞外唾液酸酶和岩藻糖苷酶切割6’-SL和2’-FL，释放唾液酸、岩藻糖和乳糖等代谢产物，从而支持长双歧杆菌婴儿亚种和短双歧杆菌在共培养中的生长增殖，尽管后者最终在细胞数量上超过两歧双歧杆菌。该研究还观察到长双歧杆菌婴儿亚种和短双歧杆菌在6’-SL存在时产生一种推测为异丁酸的化合物，但在含两歧双歧杆菌的共培养中该物质消失，提示菌群组成直接影响特定代谢物的生成。这些发现强调了在设计支持早期肠道微生物发育的合生元制剂时，必须考虑菌株间的功能互补性和底物组合效应，而非仅以单一菌株的生长能力作为筛选依据。研究结论如下：婴儿相关双歧杆菌菌株在HMOs和乳糖或单糖上的生长不能可靠预测所产生发酵代谢物的数量和特征；通过使用确定的单一和多种菌株培养，研究人员证明交叉喂养相互作用使得低丰度菌株（尤其是两歧双歧杆菌）能够对SCFA的产生产生不成比例的影响；这些结果对益生菌和合生元制剂的配方设计具有重要意义，纳入具有互补酶学功能的菌株可能是实现对特定HMOs（如6’-SL）利用和高效产生有机酸的关键，即使这些菌株在数量上不占优势。