耐高渗酵母Debaryomyces hansenii CBS 767中烷烃生物合成的组合代谢工程

《Biotechnology and Bioengineering》：Combinatorial Metabolic Engineering of Alkane Biosynthesis in the Osmotolerant Yeast Debaryomyces hansenii CBS 767

　　

Debaryomyces hansenii是一种具有多种潜在应用价值的酵母，例如从生物质生产油脂化学品（oleochemicals）。然而，由于与许多非常规生物一样，关键基因组数据和遗传元件的缺失，D. hansenii中的组合代谢工程（combinatorial metabolic engineering）受到限制。在此，研究人员报道了表型表征、基因组整合位点和模块化遗传部件，这些使得D. hansenii中烷烃生物合成的组合代谢工程成为可能。表型表征揭示，D. hansenii在标准培养基和含盐培养基中生长在木质纤维素和藻类生物质组分上时会产生脂质。值得注意的是，在以葡萄糖为碳源生长时，D. hansenii产生的脂质比Yarrowia lipolytica Po1f多57.25%。接下来，研究人员鉴定了基因组整合位点，并从D. hansenii CBS767基因组中（利用与Saccharomyces cerevisiae的已知同源性）推导出基因表达元件。研究人员推导了23个启动子和24个终止子，重新编码了已知的选择标记和报告基因，设计了基因组整合质粒，并使所有元件与模块化克隆标准兼容。流式细胞术测量表明，启动子的表达范围跨越三个数量级，终止子的表达范围跨越一个数量级。为了展示组合代谢工程，研究人员使用该部件库组装了18条烷烃生物合成途径。在没有其他基因修饰的情况下，最佳菌株分别从葡萄糖和阿拉伯糖产生了38.31 mg/L和1.47 mg/L的十七烷（heptadecane）。这项工作确立了D. hansenii作为从木质纤维素衍生糖合成油脂化学品的细胞工厂，同时为利用表型分析、基因组学和模块化部件库与自动化平台开发非常规生物细胞工厂提供了蓝图。此外，该遗传部件库现在使得Debaryomyces酵母中各种应用的功能遗传学成为可能。

**论文解读：组合代谢工程在耐高渗酵母Debaryomyces hansenii CBS 767烷烃生物合成中的应用**

酵母作为细胞工厂广泛应用于食品和化学品生产。近年来，过量生产脂肪酸的酵母备受关注，因为脂肪酸是多种油脂化学品的前体。然而，糖成本相对产品较高，限制了商业应用。廉价的木质纤维素和藻类等生物质被认为是理想的碳源，但其解聚产生大量戊糖和糖醇，许多酵母无法有效发酵。Debaryomyces hansenii是一种耐盐、耐干旱的非常规酵母，能天然同化D-葡萄糖、D-木糖、L-阿拉伯糖和甘露醇，并积累脂肪酸，最高可达干重的70%，具有作为油脂化学品平台宿主的潜力。然而，与许多非常规生物一样，D. hansenii缺乏关键基因组数据和遗传元件，其组合代谢工程受到限制。为此，研究人员开展了本研究，论文发表在《Biotechnology and Bioengineering》。

研究人员对D. hansenii CBS 767进行了表型表征，与Saccharomyces cerevisiae和Yarrowia lipolytica进行比较，确认其在多种碳源及含盐培养基中的生长和脂质积累优势。随后，研究人员鉴定了基因组整合位点，重编码了选择标记和荧光报告基因，并从D. hansenii基因组中推导出23个启动子和24个终止子，所有元件均兼容模块化克隆标准。利用该部件库，研究人员组装了18条异源烷烃生物合成途径，最佳菌株在未作其他基因修饰的情况下，从葡萄糖产生38.31 mg/L十七烷，从阿拉伯糖产生1.47 mg/L。这项工作确立了D. hansenii作为从木质纤维素来源糖合成油脂化学品的细胞工厂，为非常规生物细胞工厂的开发提供了蓝图，并使Debaryomyces酵母的功能遗传学研究成为可能。

研究使用了以下关键技术方法：菌株来自美国典型培养物保藏中心（ATCC），包括S. cerevisiae S288C、Y. lipolytica Po1f和D. hansenii CBS767。主要方法包括：表型分析（通过酶标仪测定生长曲线、核黄素荧光、尼罗红染色测定总脂质）；最低抑菌浓度（MIC）试验确定抗生素选择标记；电穿孔转化；基于Golden Gate的模块化克隆（Level 0/1/2质粒系统）；自动化液体处理（Echo 525声波移液和Eppendorf epMotion）实现高通量组装；流式细胞术（Beckman Coulter CytoFlex S VYB）表征启动子和终止子表达强度；气相色谱-质谱联用（GC-MS）定量十七烷。

**研究结果**
**3.1 D. hansenii能在重要单糖上生长并产生脂质和核黄素**。通过合成完全培养基（CSM）和海水模拟培养基（SAM）中的生长和产物测定，研究人员确认D. hansenii CBS 767能利用戊糖和甘露醇，且在SAM中生长速率更快；与Y. lipolytica和S. cerevisiae相比，D. hansenii在葡萄糖上生长快于Y. lipolytica但慢于S. cerevisiae；在所有测试条件下，D. hansenii的脂质产量均高于其他两种酵母，在含盐培养基中尤为突出；其核黄素产量在葡萄糖和甘露醇上显著高于其他菌株，但在戊糖上未积累。

**3.2 基因组工程——转化**。通过优化电穿孔方案，研究人员确定了高效转化D. hansenii的条件，包括使用对数中期细胞（OD₆₀₀为2.2–2.6）、冰冷1 M山梨醇以及含100 mM山梨醇的YPD恢复培养基。

**3.3 基因组工程——报告基因**。研究人员重编码了mVenus、mCherry和mCardinal荧光蛋白，并整合到染色体E和G。流式细胞术结果表明mCherry和mVenus均为明亮的报告基因，且染色体E整合位点的表达强度高于染色体G，因此后续实验选用染色体E位点。

**3.4 模块化遗传部件库**。研究人员利用与S. cerevisiae已知启动子和终止子的同源性，从D. hansenii基因组中鉴定并合成了23个启动子和24个终止子，全部兼容模块化克隆标准。通过自动化组装和流式细胞术表征，发现启动子的表达范围跨越三个数量级，终止子跨越一个数量级，并鉴定出一批高表达启动子（如PRPS3、PENO2等）。

**3.5 组合代谢工程生产烷烃**。研究人员设计并组装了包含2种硫酯酶（TES）、3种羧酸还原酶（CAR）和3种醛脱羧酶（ADO）的18条途径，经GC-MS定量，最佳途径（HpTES、NiCAR、PmADO）产生38.31 mg/L十七烷，为已报道酵母中ADO途径的最高滴度。

**3.6 在戊糖和己糖上的烷烃生物合成**。研究人员评估最佳途径菌株在D-葡萄糖、D-甘露醇、D-木糖和L-阿拉伯糖上的生产性能，分别产生十七烷4.53 mg/L、1.47 mg/L和痕量（木糖）。由于甘露醇和阿拉伯糖下的脂质库与葡萄糖相近但产量较低，提示辅因子限制可能是瓶颈。

**讨论与结论**
讨论部分指出，D. hansenii天然具有快速生长、替代糖分解代谢和脂肪酸高合成等优势，