《Journal of Chromatography A》：Non-target screening using fast comprehensive two-dimensional liquid chromatography-high-resolution mass spectrometry I: Investigating stability across a set of wastewater samples
编辑推荐：
全二维液相色谱-高分辨质谱(LC×LC-HRMS)改善了化合物分离效果，以及在数据非依赖采集模式下的色谱结构和质谱质量，相较于了一维液相色谱-高分辨质谱(LC-HRMS)有所提升。上述优势已被充分证实，但将LC×LC-HRMS应用于较大规模的非靶向筛查(NTS
全二维液相色谱-高分辨质谱(LC×LC-HRMS)改善了化合物分离效果，以及在数据非依赖采集模式下的色谱结构和质谱质量，相较于了一维液相色谱-高分辨质谱(LC-HRMS)有所提升。上述优势已被充分证实，但将LC×LC-HRMS应用于较大规模的非靶向筛查(NTS)样本集仍较为有限。这可能是多种因素共同作用的结果，包括仪器可及性有限、数据处理和分析要求更高，以及对第二维(2D)色谱柱在重复调制条件下使用寿命的担忧。因此，LC×LC-HRMS主要用于相对较小样本集的详细表征，而非对废水出水等较大规模环境样本序列的常规比较。仅有少数研究评估了LC×LC-HRMS在超过十次进样后的性能。Stoll等人监测了六种单克隆抗体在29次重复进样中的第一维和第二维保留时间(1tR和2tR)，报告的相对标准偏差(RSD)分别为0.03–1%和2.3–10.3%。研究人员的研究表明，LC×LC可适用于NTS应用，但LC×LC-HRMS对于大规模样本集(>30次进样)NTS的长期色谱稳定性仍缺乏充分研究，这对LC×LC-HRMS在NTS中的更广泛采用至关重要。本研究考察了LC×LC-HRMS方法在96次进样中的长期色谱稳定性。该方法总运行时间为70分钟，调制时间为27秒。在整个分析序列中，研究人员利用加标至废水出水、污水处理厂(WWTP)上游点源采集样本、质控(QC)样本和空白样本中的14种内标(IS)，通过1tR、2tR、2W4σ和峰体积评估了色谱稳定性和分离效率。废水样本于2022年10月27日至2023年2月22日期间采集自丹麦六座污水处理厂和两个点源。样本经玻璃纤维滤膜过滤后，采用多层固相萃取(SPE)方法富集至相对富集因子(REF)为500，随后稀释至REF为50。三个独立质控样本(QC1、QC2和QC3)通过等体积混合所有环境样本(n=43)制备。色谱系统为Agilent 2D-LC系统，配备自动进样器、一维泵、一维柱温箱、稀释泵、十通调制阀、两个180 μL采样环、二维柱温箱、二维泵和二维二极管阵列检测器(DAD)。一维色谱柱为Waters Acquity CSH PFP(50×2.1 mm内径，1.7 μm)，二维色谱柱为Agilent SB-C18(50×3 mm内径，1.8 μm)。高分辨质谱(HRMS)分析采用配备双喷射电喷雾离子源(ESI+)的Agilent 6546四极杆飞行时间质谱(QTOF)，采集频率为20 Hz。二维压力范围为330–580 bar。全二维峰容量考虑了欠采样校正后(n'c,2D)为1.63×103(σ:112)，对应的峰产生速率(PPR)约为40 min?1。在超过106小时的连续运行中，除Melamine-1?N?和Metformin-D6外，12种内标的1tR和2tR的RSD分别低于2.0%和1.5%，平均值分别为0.7%和0.6%。第一维和第二维峰宽(1W4σ和2W4σ)在106小时连续运行中基本保持稳定。12种保留化合物的峰体积平均RSD为6.8%，表明整个序列中灵敏度相对稳定。本研究表明，LC×LC-HRMS不仅可用于单个或少数复杂样本的详细表征，还可用于较大规模环境样本集的比较分析。尽管保留时间漂移较小，但1tR在整个色谱序列中系统性下降，由于二维采用移位梯度设计从而影响了2tR，在后续数据处理流程中应通过非刚性二维对齐算法进行校正。在调制阀废液管路上使用限流毛细管(1 m×50 μm内径)可减少调制时的压力波动。在本研究中，二维色谱柱在106小时、96次进样、约12,800次调制、最高操作压力580 bar和最大压力波动约30%的条件下性能衰减可忽略不计。总体结果表明，只要妥善管理二维保留、压力控制和色谱对齐，二维稳定性并非将快速LC×LC-HRMS应用于更大规模环境NTS研究的根本障碍。
基于LC×LC-HRMS的废水非靶向筛查长期稳定性研究解读
一、研究背景与目的
近年来，全二维液相色谱-高分辨质谱(LC×LC-HRMS)技术凭借其 superior 的峰容量和分离能力，在复杂样品分析中展现出显著优势。相较于传统一维液相色谱-高分辨质谱(LC-HRMS)，LC×LC-HRMS能够有效改善化合物分离度、提升色谱结构分辨率，并在数据非依赖采集模式下获得更优质的质谱信息。然而，尽管上述技术优势已被充分证实，LC×LC-HRMS在较大规模非靶向筛查(NTS)样本集中的应用仍然十分有限。造成这一现状的原因是多方面的：仪器设备普及度不高、数据处理流程较为复杂，以及研究人员对二维色谱柱在反复调制条件下使用寿命的担忧等。受上述因素制约，LC×LC-HRMS以往主要被用于少量复杂样本的深度表征，而很少被应用于废水出水等大规模环境样本序列的常规比较分析。
已有少数研究对LC×LC-HRMS在十次以上进样条件下的性能进行了评估。Stoll等人报道了六种单克隆抗体在29次重复进样中第一维保留时间(1tR)和第二维保留时间(2tR)的相对标准偏差(RSD)分别为0.03–1%和2.3–10.3%；另一项研究采用反相液相色谱×反相液相色谱(RPLC×RPLC)分析热解生物油水相中的酚类、酮类等化合物，证实了RSD低于6%的重复性。上述结果表明LC×LC具备应用于NTS的潜力，但针对LC×LC-HRMS在大规模样本集(超过30次进样)NTS分析中的长期色谱稳定性问题，目前的研究仍不充分。这一问题的解答对于推动LC×LC-HRMS在NTS领域的更广泛应用具有关键意义。为此，研究人员设计并实施了一项系统性的长期稳定性考察实验。
二、研究设计与主要技术方法
研究人员构建了一套完整的LC×LC-HRMS分析平台，并在此基础上系统评估了方法的长期运行稳定性。在技术实施方面，研究采用了以下几项关键方法：
(1)全二维液相色谱分离系统：一维色谱柱采用Waters Acquity CSH PFP柱(50×2.1 mm内径，1.7 μm)，二维色谱柱采用Agilent SB-C18柱(50×3 mm内径，1.8 μm)。一维流动相为含5 mM乙酸铵(AmAc)的水和甲醇，二维流动相为含0.1%甲酸(FA)的水和乙腈。一维和二维柱温分别为40°C和70°C，二维操作压力控制在330–580 bar范围内。
(2)调制与稀释系统：采用配备两个180 μL采样环的十通调制阀实现二维调制，调制时间为27秒。为防止二维色谱柱突破，在进样环前引入1:2稀释流。通过对调制阀废液管线加装50 μm内径×1 m不锈钢限流管，有效减少了调制过程中的压力波动。
(3)高分辨质谱检测：采用Agilent 6546四极杆飞行时间质谱(QTOF)，配备双喷射电喷雾离子源(ESI+)，采集频率为20 Hz。质谱与紫外(UV)检测器之间采用1:3分流比(MS:UV)。
(4)样本采集与质量控制：废水样本采集自丹麦六座污水处理厂(WWTPs)和两个点源，涵盖2022年10月至2023年2月的采样周期。样本经玻璃纤维滤膜过滤、多层固相萃取(SPE)富集至相对富集因子(REF)500后，稀释至REF 50。所有环境样本(n=43)等体积混合制备三个独立质控(QC)样本，另以Randers(Damhus?en, RD)污水处理厂样本制备两个验证QC样本。所有样本统一加标14种内标(IS)，涵盖不同极性、不同保留行为的化合物，以实现对色谱性能的多维度监控。
(5)色谱性能评估方法：分别计算两维峰容量(nc)和经欠采样校正的二维峰容量(n'c,2D)，以峰产生速率(PPR)评价活性色谱区域的分离效率；通过14种内标的1tR、2tR、二维峰宽(2W4σ)和峰体积在96次连续进样中的变化趋势，综合评估保留时间稳定性、峰宽稳定性和信号稳定性。
三、研究结果
(一)分离性能评估
对QC样本的LC×LC-HRMS基峰色谱图分析显示，二维分离空间得到了有效利用。在第一维中共洗脱的化合物可在第二维中得到进一步分离，表明两维色谱间具有良好的正交互补性。以14种内标的中位峰宽计算，一维和二维的4σ峰宽(W4σ)分别为0.9分钟和0.71秒，经欠采样校正后的二维峰容量(n'c,2D)为1.63×103(σ:112)。以41.4分钟活性色谱区域计，峰产生速率(PPR)约为40 min?1。该性能与近年报道的高性能LC×LC-HRMS方法相当，表明该方法具备在苛刻条件下评估长期色谱稳定性的充分分离效率。
(二)保留时间稳定性
通过对75个加标样本(对应106小时连续运行)的分析，12种在两维中均得到良好保留的内标展现出稳定的保留时间：1tR的RSD低于2.0%，2tR的RSD低于1.5%，平均RSD分别为0.7%和0.6%。这一精密度水平与既往报道相当或更优，证明LC×LC-HRMS能够在较大规模环境样本序列中提供可重复的二维保留时间。然而，Melamine-1?N?和Metformin-D6的2tR RSD分别高达17%和61%，其原因在于这两种化合物在二维死体积处洗脱，且Metformin-D6因聚焦不足发生了二维色谱柱突破。进一步分析揭示，保留时间的漂移呈现系统性特征：一维保留时间大于10分钟的化合物，其1tR随序列推进略有下降，而2tR相应升高。1tR的中位下降幅度为0.45分钟(相当于一次调制)，这一模式与二维移位梯度设置一致。上述漂移可能源于一维色谱柱固定相在长时间运行中的性能劣化。此外，由于不同内标的1tR和2tR位移幅度并不一致，未来在数据处理中需采用非刚性配准算法对色谱图进行对齐校正。
(三)峰宽稳定性
在106小时连续运行(对应约12,800次调制阀切换)期间，一维和二维峰宽基本保持稳定。所有化合物在一维中均以2–3个切片洗脱，且未观察到1W4σ随进样次数增加而增大的趋势。二维方面，11种内标的2W4σ约为0.7秒，Tris(2-butyloxyethyl)phosphate-D27略高(1.65秒)。通过线性回归评估二维分离效率的变化，14种内标中7种未显示显著关系(p>0.05)，其余7种中有6种呈现正斜率。排除二维保留异常的Metformin-D6后，具有显著正斜率内标的中位斜率为7.4×10??秒/次进样，即96次进样后2W4σ增加约7.1×10?2秒(约10%)。鉴于质谱扫描时间为0.055秒，该增宽幅度仅相当于约1.3次扫描，实际影响可忽略不计。研究人员认为，二维色谱柱效率的保持得益于较低的二维操作压力(330–580 bar)以及废液管限流管对调制压力波动的有效抑制。
(四)信号稳定性
14种内标的峰体积范围为6×10?至3×10?，涵盖高丰度和低丰度峰。Metformin-D6和Melamine-1?N?的峰体积在106小时运行中增加约两倍，而其余12种内标的平均RSD为6.8%，表明灵敏度在整个序列中相对稳定。进一步研究发现，Metformin-D6和Melamine-1?N?的峰体积增加与一个系统污染物离子(m/z 186.0589)的逐渐减弱相关。该污染物经MS/MS碎片谱、硫同位素比和质量精度(2.4 ppm)等证据被初步鉴定为(2/3/4)-甲磺酰基-N-甲基苯胺(置信度3级)。该污染物在一维系统中连续引入、在二维中于死体积附近洗脱，对与其共洗脱的化合物产生信号抑制。在LC×LC-HRMS系统中，由于保留化合物在第二维中与该污染物实现了色谱分离，基质抑制效应得到了有效缓解；若采用一维LC-HRMS分析，所有分析物都将暴露于该污染物持续变化的信号抑制中。这一结果凸显了LC×LC-HRMS在实际应用中的特有优势。
四、研究结论与讨论
本研究系统评估了LC×LC-HRMS方法在96次进样、106小时连续运行条件下的长期稳定性。该方法的二维分离性能(n'c,2D: 1.63×103, PPR: 40 min?1)与近年报道的高性能LC×LC-HRMS方法相当，同时展现出令人满意的保留时间精密度(1tR < 2%，2tR < 1.5%)、可忽略的二维峰展宽(4.4×10?2秒，相当于0.8次扫描)和稳定的信号强度(平均RSD为6.8%)。
本研究的核心结论可归纳为以下四点：第一，LC×LC-HRMS不仅适用于单个或少数复杂样本的精细表征，同样适用于较大规模环境样本集的比较分析，这对NTS工作流程中特征对齐、优先级排序和化学指纹跨样本比较具有重要意义。第二，分析稳定性在两维中均得到良好保留的化合物中表现最佳。来自一维系统污染物的信号抑制效应因二维分离而得到有效缓解，体现了LC×LC-HRMS相较于一维LC-HRMS的独特实际优势。第三，尽管保留时间漂移幅度较小，但1tR随序列推进呈系统性下降趋势，并通过移位梯度设计传递至2tR。后续数据处理应采用非刚性二维对齐算法对此进行校正。第四，在调制阀废液管路加装限流毛细管(1 m×50 μm内径)有效降低了调制引发的压力波动。压力波动的减小对延长二维色谱柱寿命至关重要。在本研究的运行条件下(106小时、96次进样、约12,800次调制、最高压力580 bar、最大压力波动约30%)，二维色谱柱性能衰减可忽略不计。
综上，本研究通过系统实验证明：在妥善管理二维保留行为、压力控制和色谱对齐策略的前提下，二维色谱稳定性并非将快速LC×LC-HRMS应用于更大规模环境非靶向筛查研究的根本障碍。该研究为LC×LC-HRMS从少量样本精细表征走向大规模环境样本常规监测提供了重要的方法学支撑和实证依据。
