邻乙基硝基苯光二聚驱动低浓度聚合物溶液快速光凝胶化

《Advanced Science》：Rapid Photogelation of Low-Concentration Polymer Solutions via Photodimerization of o-Ethylnitrobenzene

　　

受光刺激发生显著性质变化的聚合物因其微创性和时空可控性在生物材料中颇具前景。本研究将邻乙基硝基苯（o-ethylnitrobenzene, ENB）鉴定为高效光交联基元并引入聚乙烯醇（poly(vinyl alcohol), PVA）主链，得到一类新型可光交联水溶性聚合物。该聚合物在紫外光照射下从稀水溶液（约0.5 wt.%）中快速凝胶化（约0.5 s），形成柔弹水凝胶。所得水凝胶具高压缩回弹性，例如1.5 wt.%溶液制备的圆柱状水凝胶可承受超过10 MPa压缩应力而不断裂；2 wt.%溶液形成的水凝胶在水中各向同性溶胀达200倍，即便含水量99.99 wt.%仍具足够力学强度供徒手操作。将聚合物加入含细胞培养基并在细胞存在下光诱导凝胶化可保持细胞活性，细胞在三维空间内瞬时固定，形成高通透培养体系，经换液实现长期培养并促进大尺寸细胞球形成。上述结果凸显了ENB基水凝胶在时空可控三维细胞培养中的应用潜力。

研究背景与立项依据：光触发溶胶-凝胶转变因可实现精确定位定时的时空控制而备受关注，其中无需额外试剂的光二聚型光交联聚合物更具微创优势。传统光二聚基元（肉桂酰、蒽、香豆素、马来酰亚胺、芪、胸腺嘧啶）普遍存在需高浓度（>10 wt.%）成胶、浓溶液透光差导致深层（>1 mm）交联不足的问题，而稀溶液快速光凝胶化同时维持高力学强度的挑战长期未解。研究人员在邻硝基苯甲醛（o-nitrobenzaldehyde, NBA）衍生物前期工作中观察到疑似光交联现象，推测源于光生亚硝基二聚，进而筛选芳香硝基化合物，发现此前未被研究的邻乙基硝基苯（ENB）具优异光交联性能，据此开展本研究。论文发表于《Advanced Science》。

主要关键技术方法：研究人员采用缩醛化反应将ENB醛前体（4-ethyl-3-nitrobenzaldehyde, ENBA）与乙醇酸引入高分子量PVA侧链合成ENBPVA，并以蒽（AnthPVA）、香豆素（CumPVA）修饰PVA作对照；使用365 nm LED（240 mW cm^?2）进行光照射，通过相图接触拭子法判定溶胶/黏溶胶/凝胶态；采用万能试验机测压缩应力-应变并按初始截面积计算工程应力，结合低应变区弹性模量估算有效交联密度ν_eff；利用动态光散射（dynamic light scattering, DLS）在稀溶液非宏观凝胶条件下测光诱导簇流体力学直径；通过¹H NMR、¹³C NMR、傅里叶变换红外光谱（Fourier transform infrared spectroscopy, FT-IR）、电喷雾电离质谱（electrospray ionization mass spectrometry, ESI-MS）和紫外-可见光谱（UV–vis）解析ENB光化学反应路径；细胞实验使用HeLa与HepG2细胞系（购自RIKEN Bioresource Center），在含1–2 wt.% ENBPVA的D-PBS或培养基中悬浮后365 nm紫外光原位凝胶化，进行钙黄绿素-AM/乙锭同二聚体-1活死染色及共聚焦Z轴堆叠三维重构。

研究结果

2.1 ENBPVA的合成与光交联行为：NMR确认PVA重复单元中引入0.59 mol% ENBA与2.01 mol%羧基（改善水溶性并借静电斥力促链伸展）。0.1 wt.%溶液在365 nm照射5 s内ENB基本转化，365 nm处吸光度仅0.1–0.2，证明稀溶液厘米级透光。2 wt.%液滴照5 s成无色透明弹性凝胶；1.5 wt.%液在13 mm深硅模中单次曝光成熊形凝胶（含水98.5 wt.%）不塌。2 wt.%凝胶纯水中各向同性溶胀超10000%（体积200倍），含水99.99 wt.%仍可徒手操作。相图显示ENBPVA在1 wt.%+0.5 s即全凝胶，0.5 wt.%+1 s可凝胶；AnthPVA需≥1.5 wt.%+30 s，CumPVA需5 wt.%+300 s方成胶，证实ENB光二聚效率远优于传统基元。

2.2 ENBPVA水凝胶力学性能：1.5 wt.%圆柱样（φ3 mm×2 mm）照1 s断裂应力5.9 MPa，照60 s达10.4 MPa；1 wt.%照10 s断裂应力>2 MPa。低应变区顺从，>75%应变后陡升。有效交联密度ν_eff在照1 s内快速上升后趋缓，最大化学交联密度ν_ch,max按0.59 mol% ENB全二聚估为1.0 mol m^?3。1.5 wt.%+1 s照样循环压缩4.5 MPa三次曲线重合。同最小成胶条件下ENBPVA（1 wt.%+10 s）2.55 MPa > AnthPVA（3 wt.%+30 s）0.72 MPa > CumPVA（10 wt.%+300 s）0.11 MPa。低浓度区间（图5c）ENBPVA压缩断裂应力居已报道水凝胶最高。3 wt.%溶液夹于两PMMA柱间照40 s粘合可吊12 kg椅，扣除大气吸附后本体拉伸强度约0.1 MPa。DLS显示低光子通量（4 mW cm^?2）生成更大簇，提示低ENB*生成率促分子间交联。

2.3 ENB基元光交联机制：PVA+水溶性ENB小分子（ENBAc）混合照不凝胶，证明需共价连接；加ENBAc自由分子抑ENBPVA凝胶，加苯甲酸不抑制；加自由基捕获剂TEMPO无影响→排除自由基机理，支持侧链ENB间光二聚。¹H NMR中乙基甲基（~1.2 ppm）与亚甲基（~2.9 ppm）消失，出现α-羟乙基甲基（~1.4 ppm）与乙酰甲基（~2.6 ppm）；¹³C NMR出现α-羟乙基碳（~58 ppm）、乙酰碳（~200 ppm）及亚硝基二聚（~166 ppm）、偶氮苯（~157 ppm）、氧化偶氮（~141/146 ppm）信号；FT-IR中硝基1520/1350 cm^?1下降，3390（OH）、1705（C=O）、1240–1255（C–N/N–N）上升；MS见m/z 305/307对应二聚体脱水和加碱金属峰。综合提出路径：365 nm引发ENB分子内氧化还原，邻位乙基α-碳羟化伴生亚硝基，亚硝基（借邻位效应稳定）二聚为偶氮二氧化物交联点，续经氧化还原/脱水生成氧化偶氮或羟基胺衍生物稳定网络，长照脱水生偶氮苯致浅橙着色。

2.4 ENBPVA水凝胶构建2D/3D细胞培养：1 wt.% ENBPVA/PBS薄层经微掩模365 nm曝光、水洗后留图案化凝胶，复水可逆溶胀，贴壁细胞仅在非凝胶区铺展成线点/六边图案。含1 wt.% ENBPVA的HepG2悬液铺35 mm皿底照15 s原位成胶，细胞沉降前即固定三维；共聚焦Z轴伪色显示全厚分布均匀。加培养基后凝胶短期溶胀但结构稳超1月，>99%介质占比下氧/营养自由扩散，22天培养形成直径达500 μm细胞球，Calcein AM活染阳性，证明无自由基光凝胶化不损活力且适长期换液3D培养。

讨论与结论翻译：研究人员展示了在ENB功能化PVA中新发现的高效光交联体系。仅0.6 mol%功能化度下，1 wt.%聚合物溶液经极短光照（0.5 s）即发生显著溶胶-凝胶转变，形成兼俱柔性与高压缩断裂抗力的水凝胶，证明ENB属新型高效紧凑光交联基元。水凝胶在水中溶胀，即便含水量达99.99 wt.%仍保留徒手操作力学强度。多模态分析提出合理机制：光生具较长寿命的二聚活性物种起始交联。该原位光凝胶3D培养不损包埋细胞活力，贴壁依赖细胞形成大尺寸细胞球，证具细胞相容性。此高效光诱导溶胶-凝胶体系兼具细胞相容与光学工程兼容，厘米级瞬时凝胶化有望用于3D打印；与前报光触发溶解材料联用，可为高水合软生物环境中按需调控细胞培养提供通用平台。