褪黑素通过抑制TXNIP信号通路介导的神经炎症和小胶质细胞焦亡，改善锰诱导的小鼠神经功能障碍：SIRT6的作用

《Journal of Hazardous Materials》：Melatonin ameliorates manganese-induced neurological deficits in mice by inhibiting TXNIP signaling–mediated neuroinflammation and microglial pyroptosis: Role of SIRT6

　　

摘要

锰（Mn）的过量暴露会导致神经认知缺陷，这与海马体神经元损伤和神经炎症有关，但锰引起的海马损伤的细胞机制尚未完全明了。小胶质细胞的焦亡可能会加剧神经炎症并导致继发性神经元损伤；然而，它在锰神经毒性中的作用以及褪黑素（Mel）对其的调节作用仍不清楚。本研究利用C57BL/6小鼠（体内）和SIM-A9小胶质细胞（体外）探讨了褪黑素对锰引起的神经缺陷的保护作用。锰暴露损害了学习和记忆能力，并促进了海马体神经元损伤，同时伴随着海马小胶质细胞中NOD样受体家族pyrin结构域包含蛋白3（NLRP3）介导的焦亡信号通路的增强。褪黑素减弱了小胶质细胞的焦亡和神经元损伤，而不会显著降低海马体、血液或尿液中的锰水平。锰破坏了硫氧还蛋白（Trx）/硫氧还蛋白相互作用蛋白（TXNIP）的氧化还原轴，并增强了TXNIP–NLRP3之间的相互作用。Txnip的过表达加强了这种相互作用，并削弱了褪黑素对小胶质细胞焦亡的保护作用。此外，褪黑素增强了Sirtuin 6（SIRT6）的活性和核内SIRT6的表达，降低了Txnip启动子区域H3K9ac和H3K56ac的乙酰化程度，并抑制了锰诱导的TXNIP过表达。这些发现表明，褪黑素通过部分恢复SIRT6介导的Txnip的表观遗传抑制作用以及减少TXNIP/NLRP3驱动的小胶质细胞焦亡，从而减轻了与锰相关的海马神经炎症损伤。

引言

锰是一种天然存在的微量元素，存在于地壳、土壤、岩石、水中以及各种食物来源中。虽然它对生理功能至关重要，但其过量暴露可能导致神经毒性[1]、[2]、[3]。环境和职业暴露于锰仍然是公共卫生问题，尤其是在饮用水受到污染、焊接、采矿和其他工业活动的环境中[4]、[5]。吸入和摄入是锰暴露的主要途径[1]、[2]。中枢神经系统（CNS）对锰引起的毒性非常敏感。最近的流行病学研究表明，环境、职业或产前锰暴露与特定的神经认知改变有关，尤其是学习、记忆、注意力和执行功能[6]、[7]、[8]、[9]。实验研究也支持这些发现，动物模型中的锰暴露导致了学习和记忆能力的下降[10]、[11]。海马体对于空间学习和记忆至关重要[12]，但由于锰暴露，它容易受到神经元损伤、氧化应激和神经炎症的影响[13]、[14]。这些发现表明，海马损伤可能是锰导致的学习和记忆缺陷的重要病理基础。然而，将锰引起的海马神经炎症与神经元损伤及学习和记忆障碍联系起来的细胞机制尚未完全明了，特别是在胶质细胞介导的炎症反应方面。

胶质细胞是神经炎症的关键介质。小胶质细胞作为中枢神经系统中的主要神经免疫细胞，可以通过上调促炎细胞因子（如肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、白细胞介素-1β（IL-1β）和IL-6）的水平来促进炎症激活，从而加重神经元损伤[15]、[16]。小胶质细胞的焦亡与神经炎症密切相关，构成了一个正反馈的炎症循环。持续的炎症刺激和细胞应激可以激活小胶质细胞中的炎性体信号通路并触发焦亡性细胞死亡。焦亡的小胶质细胞会释放生物活性形式的IL-18和IL-1β以及其他促炎因子，这些因子会增强神经炎症反应并加剧继发性神经元损伤[17]、[18]。氧化应激和神经炎症在锰神经毒性的发病机制中并非独立事件；相反，它们紧密相关且相互促进[2]、[19]。据报道，锰引起的氧化应激会促进NLRP3炎性体依赖的焦亡，这表明氧化损伤可能是炎症细胞死亡的上游触发因素[20]、[21]、[22]。硫氧还蛋白相互作用蛋白（TXNIP）是一种对氧化还原敏感的结合伴侣和硫氧还蛋白的内源性抑制剂，可能将氧化应激与NLRP3炎性体激活联系起来[23]、[24]。然而，TXNIP是否参与了锰诱导的小胶质细胞焦亡，从而促进海马神经炎症和神经元损伤，仍不清楚。

褪黑素（Mel）是一种天然的昼夜节律调节剂，以其抗氧化、抗炎和神经保护作用而闻名[25]、[26]。由于其两亲性特性，褪黑素可以轻易进入中枢神经系统并发挥神经保护作用[25]、[26]。先前的研究表明，褪黑素通过调节自噬相关途径和抑制氧化应激及炎症损伤模型中的TXNIP/NLRP3介导的炎症损伤来减轻神经炎症[27]、[28]、[29]。这些结果提示，TXNIP的下调可能是褪黑素抗炎和神经保护作用的分子机制[28]、[29]。Sirtuin 6（SIRT6）作为一种核内烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD?）依赖的去乙酰化酶，在染色质重塑和转录调控中起作用，并已知能抑制TXNIP的表达[30]。此外，褪黑素与SIRT6相关的保护性信号通路有关[31]。我们假设SIRT6可能参与了褪黑素介导的TXNIP下调，从而可能减轻锰诱导的小胶质细胞焦亡。

已有研究表明褪黑素可以减轻神经炎症损伤。然而，其对抗锰诱导的小胶质细胞焦亡的保护作用及其机制尚不完全清楚。在这项研究中，我们使用了暴露于锰的C57BL/6小鼠模型来确定褪黑素是否能够减轻海马神经炎症、小胶质细胞焦亡、神经元损伤以及学习和记忆缺陷。然后，我们使用过表达Txnip或敲低Sirt6的SIM-A9小胶质细胞来探讨SIRT6对Txnip的表观遗传调控是否通过TXNIP/NLRP3通路影响褪黑素对锰诱导的小胶质细胞焦亡的保护作用。本研究的目的是明确潜在的褪黑素–SIRT6–TXNIP/NLRP3通路是否有助于保护海马免受锰引起的神经炎症损伤。

节片段

动物

所有动物实验均获得了中国医科大学伦理委员会（CMU20240548）的批准，并遵守了美国国立卫生研究院（NIH）关于实验室动物护理和使用的指南。实验使用了6周大的雄性C57BL/6小鼠，这些小鼠处于无特定病原体（SPF）环境中。小鼠被随机分为五组，每组10只。（1）对照组接受0.9%盐水；（2）锰组通过

褪黑素减轻了锰引起的大脑海马神经元损伤和神经炎症

为了评估褪黑素对锰诱导的神经毒性的体内保护作用，C57BL/6小鼠接受了含或不含褪黑素的MnCl₂处理，持续6周，随后进行了行为测试、锰积累、组织病理学和炎症评估（图1A）。在Morris水迷宫测试中，暴露于锰的小鼠在获取阶段表现出较长的逃逸潜伏期，表明其空间学习能力受损。然而，褪黑素预处理，特别是20mg/kg的褪黑素处理，部分缩短了

讨论

小胶质细胞的焦亡似乎是锰引起的海马神经炎症损伤中的一个重要病理事件[17; 18]。在本研究中，锰暴露引发了海马神经炎症，激活了NLRP3介导的小胶质细胞焦亡信号通路，并导致神经元损伤和学习记忆能力下降。褪黑素减轻了这些由锰引起的病理变化，包括炎症反应、小胶质细胞焦亡和继发性神经元损伤，同时没有显著降低锰的水平

结论

总之，锰暴露促进了海马小胶质细胞中的NLRP3介导的焦亡信号通路，加剧了神经炎症，导致神经元损伤和神经功能缺陷。褪黑素部分恢复了SIRT6介导的Txnip的表观遗传抑制作用，从而限制了锰暴露下的TXNIP/NLRP3介导的小胶质细胞焦亡信号通路。这些发现表明，调节小胶质细胞焦亡的SIRT6–TXNIP/NLRP3轴可能参与了锰引起的神经毒性及褪黑素的相关作用

环境影响

CRediT作者贡献声明

Bin Xu：撰写——审稿与编辑、验证、监督、概念构思。Changjiang Yu：方法学、正式分析。Zhuo Ma：监督。Jia Liu：撰写——初稿、可视化、验证、正式分析、数据管理。Keyu Chen：可视化、验证、数据管理。Kuan Liu：方法学、正式分析。Jixing Liang：可视化、验证、数据管理。

利益冲突声明

作者声明他们没有已知的可能影响本文研究的财务利益或个人关系。

致谢

本研究得到了中国国家自然科学基金（项目编号：82304099；82504376）和2020年中国辽宁创新型人才培养计划的支持。

利益冲突声明

作者声明没有利益冲突。

Jia Liu|Jixing Liang|Keyu Chen|Kuan Liu|Changjiang Yu|Zhuo Ma|Bin Xu

环境压力与慢性疾病控制和预防重点实验室（中国医科大学），教育部，辽宁沈阳110122，中国