AI驱动的温度分辨离心微流控用于生物分子凝聚体快速三维相图生成

《Advanced Science》：AI-Powered, Temperature-Resolved Centrifugal Microfluidics for Rapid 3D Phase-Diagram Generation of Biomolecular Condensates

　　

生物分子相分离驱动无膜细胞器的形成，并涉及多种疾病。绘制多维相图对于理解凝聚体组装机制和开发治疗干预至关重要，但现有方法缓慢、资源密集，且通常局限于单一（且常为非生理性）温度。研究人员在此提出T-PhaseMap，一种人工智能（AI）驱动的离心微流控平台，该平台整合了可编程浓度梯度生成、独立温度控制和深度学习分析，可在30分钟内构建成分-温度空间上的三维（3D）相图。研究人员展示了双尺度策略，能够实现对相空间的广域探索和临界转变边界的局部细化。同时，可调的三节点温度控制（25°C、37°C和45°C）提供了结构化的温度维度，用于系统评估温度依赖性相行为。一个基于VGG-16的四分类器进一步区分两相凝聚体、单相状态、边界状态和类聚集体表型，在包含720张图像的独立测试集上实现了约99.3%的准确率。将T-PhaseMap应用于肝素钠介导的凝聚体调节，揭示了在25°C–45°C温度范围内表观抑制效能存在17.6%的温度依赖性变化。该平台为生理相关的相图生成和靶向凝聚体的治疗药物高通量筛选提供了快速、客观的工具。

生物分子相分离（phase separation）是驱动细胞内无膜细胞器（membraneless organelles）形成的基本组织原理，与肌萎缩侧索硬化（ALS）、阿尔茨海默病及癌症等多种病理过程密切相关。相图可定量描述相行为随成分的变化，是预测相分离发生和比较不同条件下的核心工具。然而，现有相图绘制方法通量低、耗时长，且往往将温度固定为室温（25°C），忽略了生理温度（37°C）和病理发热温度的影响。由于温度可移动相边界、甚至诱导可逆的应激响应凝聚体形成，缺乏温度维度的研究可能掩盖关键生物学机制，并误导治疗效果评估。为突破这一瓶颈，研究人员开发了T-PhaseMap——一种AI驱动的温度分辨离心微流控平台。

T-PhaseMap将离心微流控浓度梯度生成、外置温度控制模块和基于VGG-16的深度学习分类相结合，可在30 min内自主构建成分-温度空间的高密度三维（3D）相图。该平台采用双尺度策略，既能广域筛选相空间，又能局部细化临界边界，并通过三节点（25°C、37°C、45°C）温度控制提供结构化的热力学维度。在720张独立测试图像上，四分类器准确率达约99.3%。应用该平台研究肝素钠对polyU/RRASLRRASLRRASL凝聚体的调节作用，发现其抑制效能随温度变化达17.6%，表明温度分辨的药物筛选具有必要性。该工作为生理相关相图生成和靶向凝聚体的治疗药物高通量筛选提供了快速、客观的工具，相关成果发表于《Advanced Science》。

研究人员开展研究用到的主要关键技术方法包括：采用CO₂激光切割和热压层压工艺制备聚甲基丙烯酸甲酯（PMMA）微流控芯片；利用离心驱动实现顺序加样、混合和梯度分配；通过芯片上的梯度浓度生成器（GCG）单元产生6个浓度水平，并与外置环形电阻加热器及闭环温度控制器结合，在25°C、37°C和45°C下进行热孵育；基于VGG-16构建四分类卷积神经网络，结合旋转和裁剪等数据增强策略训练；使用径向基函数核支持向量机（RBF-SVM）对分类标签进行三维决策曲面重建；通过荧光恢复（FRAP）、液滴融合和形态学定量分析验证凝聚体性质。样本为体外重组蛋白系统，无临床样本队列。

研究结果如下：

**2.1 平台设计与操作**：T-PhaseMap由自动化离心微流控装置、独立温控模块和深度学习分析流程组成。研究验证了可编程离心驱动、闭环温控和倒置芯片-加热器成像配置，实现多温度平行评估，端到端流程小于30 min。

**2.2 双尺度策略和可扩展3D相图构建**：以polyU/RRASLRRASLRRASL模型系统验证，每个GCG单元产生6个浓度水平×3个温度=18个条件。通过调整Reactant 1的初始浓度范围，可在宽域筛查与局部分辨之间切换。两阶段策略先生成广域探索相图快速定位边界，再在边界附近加密采样构建高分辨率局部相图，并可集成为统一相面。

**2.3 深度学习实现快速自动相态分类**：VGG-16模型将微室图像分为两相凝聚体、单相状态、边界状态和类聚集体表型。形态学描述符（凝聚体计数、面积、等效直径、变异系数、分配系数K）显示四类间差异显著（调整后p<0.0001）。五折交叉验证显示高准确率；与ResNet-18和EfficientNet-B0相比，VGG-16性能最佳。独立测试集（720张图像）准确率约99.3%，仅5张单相图像被误分类为边界状态。

**2.4 Krt1凝聚体的温度和PEG8000依赖性相行为**：将平台推广至全长小鼠Krt1蛋白系统，在固定Krt1浓度约2.43 μm下，构建了盐浓度、PEG8000浓度（% w/v）和温度的三维相图。结果表明，升高温度促进Krt1凝聚（呈现LCST样倾向），增加盐浓度抑制液滴形成，低盐条件倾向形成类聚集体表型；增加PEG8000浓度扩大两相区。这说明Krt1相行为是温度、离子强度与分子拥挤共同作用的结果。

**2.5 温度依赖性药物效应**：以肝素钠为模型扰动剂加入预形成的polyU/RRASLRRASLRRASL凝聚体，发现肝素钠导致液滴缩小并最终溶解。通过定义临界抑制浓度chep,crit和浓度加权平均临界浓度，量化了肝素钠效能。结果显示，在25–45°C内抑制效能变化17.6%。无肝素钠时系统呈LCST样趋势（升温促进相分离），而含肝素钠后升温扩大单相区，呈UCST样趋势，表明肝素钠抑制效应具有显著温度依赖性。

讨论部分指出，T-PhaseMap的主要优势在于将温度显式纳入实验维度、高分类准确率和快速流程。温度分辨测量揭示了肝素钠的抑制效应随温度变化，提示室温实验可能低估或高估药物效力。局限性在于，RBF-SVM重建的三维曲面为计算插值，不能直接代表热力学连续性。在31°C和41°C的补充验证中，模型预测与实验标签的准确率为94.44%–98.61%，偏差集中在相边界附近。未来可通过更高密度温度采样和动态测量（如FRAP、时间序列成像）进一步提升。研究结论可翻译为：总的来说，T-PhaseMap提供了一种快速、高效且直观的方法，用于在耦合的成分-温度空间中对凝聚体相行为进行图谱化映射。