《Journal of Hazardous Materials Advances》：Sustainable Arsenic Bioremediation by a Marine Macroalgal Endophyte,
Bacillus subtilis ULB16
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摘要
砷污染，尤其是以高毒性和高迁移性的亚砷酸盐（As(III)）形式存在的砷污染，对环境可持续性、农业生产力和食品安全构成严重威胁。利用天然具有抗逆性的微生物进行生物解毒为传统修复方法提供了一种可持续的替代方案。本研究评估了分离自石莼（Ulva lactu
摘要
砷污染，尤其是以高毒性和高迁移性的亚砷酸盐（As(III)）形式存在的砷污染，对环境可持续性、农业生产力和食品安全构成严重威胁。利用天然具有抗逆性的微生物进行生物解毒为传统修复方法提供了一种可持续的替代方案。本研究评估了分离自石莼（Ulva lactuca）的海洋大型藻类内生菌枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）ULB16的As(III)耐受性、解毒潜力及砷抗性的遗传基础。该菌株对As(III)的最低抑菌浓度（MIC）为12 mg/mL，并能在较宽的pH范围（4-11）和28-45°C的温度范围内维持生长。As(III)暴露诱导了菌落形态、细胞表面超微结构及细胞被膜相关功能基团的变化，表明其存在对砷胁迫的适应性响应。电感耦合等离子体质谱（ICP-MS）分析表明，48小时内约80%的砷从培养基中被去除，且胞内砷积累可忽略不计，而定性硝酸银实验证实了As(III)被氧化为As(V)。在水培系统中，细菌处理减轻了As(III)对绿豆（Vigna radiata）诱导的植物毒性，与直接接种相比，对含As(III)培养基进行预处理可使植物生长恢复更佳，且植物组织中砷积累极少。全基因组测序鉴定出多个砷抗性相关基因，包括arsR、arsB、arsC、czrA和cotA，为观察到的砷耐受性提供了分子基础。总之，生理学、分析学和基因组学的研究结果表明，枯草芽孢杆菌ULB16具有多种砷抗性性状，并凸显了其作为生物砷修复潜在候选菌株的应用前景。
论文解读：海洋大型藻类内生菌Bacillus subtilis ULB16的砷生物修复潜力研究
**1. 研究背景与意义**
砷（As）是一种普遍存在的有毒类金属，广泛分布于陆生和水生环境中，被公认为全球最具危害性的环境污染物之一。在其各种化学形态中，无机As(III)因其高溶解性、生物利用度和对细胞巯基的强亲和力而成为毒性最强、迁移性最高的形态。砷污染来源既包括自然地质过程，也包括采矿、冶炼、工业排放、地下水过度开采、农药施用、化石燃料燃烧及含砷农用化学品使用等人类活动。通过地下水介导的迁移，砷污染已波及全球许多地区的饮用水和农业土壤，对生态系统健康、农业生产力和粮食安全构成严重威胁。无机砷在农作物中的积累，尤其是利用砷污染灌溉水种植的水稻，已成为全球性的重大食品安全关切。慢性砷暴露与致癌、致突变、神经、心血管及发育障碍相关，国际癌症研究机构（IARC）已将无机砷列为第一类人类致癌物。传统砷去除的理化方法，如化学沉淀、混凝絮凝、膜过滤、离子交换及合成材料吸附等，往往存在运行成本高、能耗大、产生污泥以及低砷浓度下效率降低等问题。因此，生物修复作为一种环境友好、成本效益高且能通过天然微生物过程将砷转化为毒性更低或迁移性更弱形态的替代方案而备受关注。尽管已从陆地、淡水和工业环境中分离出大量耐砷细菌，但砷抗性和解毒具有高度的菌株依赖性，亲缘关系密切的细菌物种之间在金属耐受性、砷转化能力、胁迫适应性和遗传组成方面均存在显著差异。因此，从尚未充分开发的生态位中鉴定和表征细菌对于扩展可持续砷生物修复微生物的多样性具有重要意义。与陆生和自由生活的细菌相比，海洋大型藻类内生菌在砷解毒潜力方面的研究相对较少。本研究基于此背景，对分离自海洋大型藻类石莼的内生菌Bacillus subtilis ULB16的砷生物修复潜力进行了系统研究。该论文发表在《Journal of Hazardous Materials Advances》。
**2. 主要技术方法**
研究人员采用多种关键技术方法开展研究：通过微量肉汤稀释法测定最低抑菌浓度（MIC）和最低杀菌浓度（MBC）；利用扫描电子显微镜（SEM）观察细胞超微结构变化；采用傅里叶变换红外光谱（FT-IR）分析细胞表面功能基团变化；使用电感耦合等离子体质谱（ICP-MS）定量测定砷的去除效率及分布；通过硝酸银显色法定性检测As(III)氧化能力；构建绿豆（Vigna radiata）水培体系评估细菌缓解砷植物毒性的效果；运用全基因组测序及生物信息学工具（RASTtk、Proksee、BLASTX、InterProScan等）进行基因组注释和砷抗性基因鉴定，并采用最大似然法构建系统发育树进行分析。
**3. 研究结果**
**3.1 重金属抗性潜力评估**
通过微量肉汤稀释法评估了菌株对多种重金属的抗性，发现Bacillus subtilis ULB16对As(V)、As(III)、铜和镉具有抗性，但对汞、铅和铬敏感。鉴于As(III)的高毒性和环境重要性，后续研究聚焦于该形态。
**3.2 As(III)胁迫下的生长响应与形态适应**
研究发现As(III)暴露显著改变了菌落形态，使其变得更小、更紧凑、更光滑，边缘分支减少，并产生明显的棕色色素。场发射扫描电子显微镜（FE-SEM）观察显示，As(III)处理后的细胞表面变得粗糙、皱缩、不均匀，出现可见凹陷和不对称轮廓，部分细胞末端或中部肿胀，表明细胞被膜完整性受到干扰。傅里叶变换红外光谱（FTIR）分析显示，As(III)暴露后，代表蛋白质和多糖的-OH/-NH伸缩振动、脂质C-H伸缩振动、蛋白质酰胺I和II带、C-H弯曲振动及碳水化合物C-O伸缩振动的特征吸收峰均发生位移，表明细胞表面功能基团的化学环境发生变化，这些基团可能参与砷的吸附和解毒过程。生长动力学实验表明，该菌株在100 μg/mL As(III)存在下经过短暂延滞期后仍能维持活跃生长。
**3.3 As(III)耐受性及MIC/MBC测定**
通过梯度浓度实验确定Bacillus subtilis ULB16对As(III)的最低抑菌浓度（MIC）为12 mg/mL，该值显著高于文献报道的其他耐砷芽孢杆菌菌株（通常为0.5-5 mg/mL）。最低杀菌浓度（MBC）实验表明，即使在高浓度（50 mg/mL）As(III)暴露后，菌株仍能恢复生长，说明As(III)对该菌株的抑制作用为抑菌性而非杀菌性。
**3.4 pH和温度对As(III)抗性的影响**
研究发现该菌株在pH 4-11范围内均能维持生长，最适pH为中性至微碱性（7-8）；在温度28-37°C生长最佳，且在45°C下仍能存活。这表明菌株在砷胁迫下具有较宽的pH和温度适应范围。
**3.5 As(III)氧化潜力的定性检测**
通过硝酸银显色实验，在含As(III)的CDM平板上观察到深棕色沉淀（Ag?AsO?），证实Bacillus subtilis ULB16具有将As(III)氧化为As(V)的能力，这是一种重要的砷解毒策略。
**3.6 ICP-MS定量分析砷去除效率**
电感耦合等离子体质谱（ICP-MS）分析结果显示，48小时内约80%的砷从培养基中被去除。对菌体生物量分析发现，胞内砷积累可忽略不计，而通过0.1 N HCl洗涤生物量回收了约80%被去除的砷，表明砷主要通过表面吸附机制被去除，该结果与FTIR分析中表面功能基团的参与相吻合。
**3.7 绿豆水培体系中砷毒性的缓解**
水培实验表明，Bacillus subtilis ULB16处理能显著缓解As(III)对绿豆（Vigna radiata）的植物毒性。将含As(III)培养基经菌株预处理24小时后再移栽幼苗，根和茎长度恢复至与未胁迫对照相当的水平，且植物组织中砷积累量极低（预处理组低于检测限），显著优于移栽时直接接种的处理。
**3.8 全基因组测序及砷抗性基因鉴定**
全基因组测序显示Bacillus subtilis ULB16基因组大小为4,025,851 bp，GC含量为56.44%，共编码3,774个蛋白质编码序列（CDS）。基因组注释鉴定出多个砷抗性相关基因，包括arsR（转录调控因子）、arsB（As(III)外排转运蛋白）、arsC（砷酸还原酶）、czrA（金属响应转录抑制因子）和cotA（多铜氧化酶/漆酶）。在contig 2上鉴定出arsR-acr3-arsC基因排列，在contig 6上鉴定出arsC-arsB-arsR基因排列。系统发育分析表明这些蛋白与已知砷抗性蛋白具有序列水平的亲缘关系。值得注意的是，基因组中未鉴定出经典的AioAB亚砷酸盐氧化酶基因，但表型实验显示明确的As(III)氧化能力，提示CotA可能作为替代性的砷氧化酶发挥作用。
**4. 讨论与结论**
讨论部分指出，Bacillus subtilis ULB16对As(III)的耐受性远高于多数已报道的耐砷芽孢杆菌，这可能与其分离自海洋环境、长期适应金属丰富且动态变化的生境有关。研究结论总结如下：海洋大型藻类内生菌Bacillus subtilis ULB16展现出优异的砷耐受性，其MIC为12 mg/mL，能在pH 4-11和28-45°C范围内生长；具有As(III)氧化能力，48小时内去除约80%的培养基砷；能在水培体系中缓解As(III)对绿豆的植物毒性；全基因组测序鉴定出arsR、arsB、arsC、czrA和cotA等多个砷抗性相关基因，为其砷抗性表型提供了分子基础。多种砷抗性性状的整合表明，该菌株的砷抗性涉及互补的多重过程而非单一解毒机制。该研究将海洋大型藻类内生菌确认为砷生物修复的潜在候选菌株来源，为开发新型可持续砷污染修复策略提供了理论基础和实验室规模证据。但研究仍属实验室规模评估，未来需要进一步开展砷抗性基因的功能表征、As(III)转化的定量评估，以及在土壤、废水和现场条件下的应用研究。
