《CNS Neuroscience & Therapeutics》：Integrated Genomic and Proteomic Analysis Reveals T-B Lymphocyte Signatures in the MYCN Driven “Immune Desert” of Specific Neuroblastoma Subtypes
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**摘要**
**目的**：本研究旨在系统解析MYCN扩增如何在高危神经母细胞瘤中塑造免疫抑制性肿瘤微环境（tumor microenvironment, TME），阐明免疫逃逸的关键机制。
**方法**：研究人员对批量RNA测序（bulk RNA-s
**摘要**
**目的**：本研究旨在系统解析MYCN扩增如何在高危神经母细胞瘤中塑造免疫抑制性肿瘤微环境（tumor microenvironment, TME），阐明免疫逃逸的关键机制。
**方法**：研究人员对批量RNA测序（bulk RNA-seq，n=721）、单细胞RNA测序（single-cell RNA-seq，n=9）、蛋白质组学数据（n=49）和空间转录组学（Visium，并在黑色素瘤中进行外部验证）进行了整合多组学分析。分析包括无监督聚类、细胞间通讯推断、转录调控网络重建和空间邻近性评估，以描绘免疫景观。
**结果**：一个以MYCN扩增和不良预后为特征的独特分子亚型（C类）表现出全面的“免疫沙漠”表型，其特征是免疫评分低和白细胞浸润极少。单细胞分析证实C类TME中T淋巴细胞和B淋巴细胞显著耗竭。研究识别出失调的转录网络，包括T细胞中REL和EOMES的上调——其中EOMES可能通过调节瞬态受体电位（Transient Receptor Potential, TRP）基因驱动耗竭，而REL抑制在体外增强细胞毒性功能。一个独特的免疫抑制性B细胞亚群（B7）与耗竭T细胞发生增强的串扰，并 harbored 一个与细胞周期失调和不良生存相关的MYC中心网络。空间转录组学揭示了B7活跃区域与Treg/耗竭富集区域之间的显著邻近性，并在黑色素瘤中得到外部验证。蛋白质组学数据验证了MYCN扩增肿瘤中REL表达升高。
**结论**：这项工作描绘了MYCN驱动的神经母细胞瘤的免疫抑制结构，揭示了特定淋巴细胞区室内的新型调控节点。通过整合单细胞、空间和蛋白质组学证据，研究人员提出REL抑制作为治疗候选方案，EOMES/TRP轴作为生物信息学支持的假设，以及B7/MYC枢纽作为由转录组和空间证据支持的假设。
**整合多组学解析MYCN驱动的神经母细胞瘤“免疫沙漠”中T-B淋巴细胞特征——论文解读**
**研究背景与问题**
神经母细胞瘤（neuroblastoma, NB）是起源于神经嵴细胞的异质性儿童肿瘤，其肿瘤微环境（tumor microenvironment, TME）由肿瘤细胞、基质细胞、免疫细胞及信号分子和细胞外基质构成，共同调控肿瘤进展与免疫逃逸。抗肿瘤免疫应答可被概念化为“癌症-免疫循环”（Cancer-Immunity Cycle, CIC），该循环的平衡决定了TME处于免疫活跃（“热”）还是免疫抑制（“冷”）状态。MYCN扩增是神经母细胞瘤中最具侵袭性的遗传改变之一，与不良预后密切相关，但其如何系统性塑造免疫抑制性TME、驱动免疫逃逸的分子机制仍不完全清楚。既往研究表明MYCN可下调MHC I类分子表达、抑制cGAS-STING/干扰素通路，并影响NK细胞活化配体，但缺乏多组学、多尺度整合的系统性刻画。为此，研究人员整合了批量转录组、单细胞转录组、蛋白质组和空间转录组数据，旨在高分辨率解析MYCN驱动的高危NB中免疫抑制微环境的细胞组成、转录调控网络及空间组织，特别关注T-B淋巴细胞间的串扰及其在组织微环境中的空间布局。
**研究设计与核心发现**
该研究通过无监督聚类在721例NB bulk RNA-seq样本中定义了四种分子亚型（A-D），其中C类高度富集MYCN扩增（占全部扩增病例的92.75%）和致死结局（占全部死亡的61.22%），并表现出全面免疫抑制特征——ESTIMATE免疫/基质评分最低、肿瘤纯度最高，ssGSEA显示28种免疫细胞浸润、CIC七步活性及趋化因子、MHC分子等免疫相关分子表达均显著降低，被定义为“免疫沙漠”。基于9例高危原发NB样本（32,363个细胞）的单细胞图谱，利用Scissor算法将bulk表型投射至单细胞分辨率，发现C类TME中总免疫细胞比例下降，T、B淋巴细胞显著减少，而基质细胞增多。进一步对T淋巴细胞亚群分析发现，C类T细胞中847个差异表达基因（DEGs）显著富集Rho GTPase循环、趋化因子信号和B细胞受体信号通路；转录因子预测和蛋白质组验证共同指向REL在MYCN扩增肿瘤的T细胞中上调，体外实验证实REL抑制剂IT-901可将PBMC对肿瘤细胞的杀伤效率提高约1.45倍。此外，EOMES被预测可能通过结合TRP家族基因启动子调控T细胞耗竭。对B淋巴细胞的分析鉴定出10个亚群，其中B7亚群在C类中表现出MYC驱动的细胞周期失调，并作为“信号接收者”与耗竭T细胞和Tregs发生增强的配体-受体互作（如CCL3/4/5-CCR1/5、CCL20-CCR6、TNF超家族）。空间转录组学证实B7核心活性区域与Treg/耗竭富集区域在NB组织切片中存在显著空间邻近，并在独立黑色素瘤数据集中得到外部验证。这些发现将MYCN驱动的免疫抑制从简单的细胞数量减少推进至特定淋巴细胞亚群的功能重编程和空间组织层面。
**主要技术方法**
研究利用了公共数据库中的多组学数据：批量RNA-seq来自GSE49710（498例）和EMTAB8248（223例）；单细胞RNA-seq来自GSE147766（9例高危原发样本）；蛋白质组数据来自PXD018300（49例）；空间转录组来自GSE309269（NB颈部淋巴结转移）和GSE250636（黑色素瘤）。分析流程包括Seurat标准化与CCA/MNN批次校正、CopyKAT推断拷贝数变异区分肿瘤/正常细胞、Scissor算法将bulk表型映射至单细胞、CellCall推断细胞间通讯及配体-受体-转录因子（LR-TF）轴、iRegulon预测转录因子、scCODE差异分析、空间邻近性距离计算等。
**研究结果**
**3.1 纳入样本的一般特征**：经质量控制，共纳入721例NB bulk样本、9例scRNA-seq样本（32,363个细胞）和49例蛋白质组样本。**3.2 无监督聚类定义四种分子亚型**：bulk数据清晰分离为A（n=242）、B（n=199）、C（n=170）、D（n=110）四型，且能整合两个独立数据集。**3.3 免疫景观揭示C类为“免疫沙漠”**：ESTIMATE评分、免疫细胞浸润、CIC活性和免疫相关分子表达均一致显示C类全面免疫抑制，并富集增殖、DNA修复和代谢相关HALLMARK通路。**3.4 scRNA-seq质量控制与图谱构建**：整合后鉴定出10种主要细胞类型，包括T细胞（11,216）、B细胞（3,445）、巨噬细胞、单核细胞、NK细胞等。**3.5 Scissor投射揭示C类TME中T/B淋巴细胞比例降低**：与NOC相比，C类免疫细胞整体减少，T/B淋巴细胞下降尤为显著。**3.6 T细胞亚群在C类中发生功能改变**：11个T细胞亚群中，C类T细胞富集免疫抑制相关通路，并鉴定出847个DEGs。**3.7 关键转录因子REL和EOMES的调控作用**：REL在多数T细胞亚群中上调，蛋白质组验证其蛋白水平在MYCN扩增组升高；虚拟敲除REL影响趋化因子、线粒体及核糖体相关基因；IT-901处理显著增强PBMC杀伤。EOMES可能通过调控TRP通道基因促进T细胞耗竭。**3.8 B淋巴细胞亚群鉴定及细胞周期失调**：10个B细胞亚群中，B7在C类中高表达细胞周期相关基因，HALLMARK富集显示MYC靶点、氧化磷酸化和mTORC1通路激活。**3.9 T-B淋巴细胞间通讯向免疫抑制方向转变**：CellCall分析显示，C类中耗竭T细胞和Tregs通过趋化因子、TNF等信号与B7亚群形成增强通讯，B7从NOC中的信号“发送者”转变为C类中的主要“接收者”；下游TF分析揭示B7内MYC中心网络激活，且11个TF与NB患者总生存相关。空间分析进一步证实B7核心区域与Treg/耗竭区域在组织学上邻近，并在黑色素瘤中重现该模式。
**讨论与结论**
本研究通过多组学整合，系统刻画了MYCN驱动NB的“免疫沙漠”TME，首次将bulk表型精准映射至单细胞亚群，揭示T、B淋巴细胞并非简单数量减少，而是经历深刻的功能重编程。在T细胞中，REL被证实为可药用的免疫调控靶点——体外抑制REL可增强抗肿瘤杀伤；EOMES/TRP轴则提出了全新的T细胞耗竭调控假设。B7亚群作为一个被忽视的免疫抑制枢纽，通过MYC驱动的细胞周期程序与耗竭T细胞和Tregs形成正反馈抑制回路，空间共定位结果提示了直接的微环境互作可能。研究尚存局限性：单细胞和蛋白质组样本量有限、批次效应无法完全排除、EOMES-TRP轴和B7/MYC枢纽缺乏直接扰动实验验证、空间邻近不能证明细胞直接接触。综上，研究人员提出一个工作模型：MYCN扩增的肿瘤细胞建立免疫抑制基础，T细胞向耗竭倾斜且REL可被药物干预，B7亚群经MYC驱动失调后成为与耗竭T细胞和Tregs通讯的枢纽，共同维持“免疫沙漠”。结论部分指出，整合单细胞、空间和蛋白质组证据，识别出三个相互关联的治疗节点：REL抑制（有功能学验证支持）、EOMES/TRP轴（新机制假说）以及B7-MYC通讯枢纽（空间证据支持的B细胞生物学新方向），为这一侵袭性疾病的免疫治疗提供了多角度候选策略。
