《Journal of Hazardous Materials》：Chemotactic sensing of extracellular antibiotic resistance genes enables their efficient removal by
Stutzerimonas stutzeri
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摘要抗生素抗性基因（ARGs）在废水环境中的传播对公共卫生构成了严重威胁。胞外 ARGs（eARGs）作为游离 DNA 片段持久存在，难以被传统的物理化学处理技术有效去除。在此，我们从市政污水中分离出斯图德氏斯图德菌（Stutzerimonas stutzeri）CHY07，
摘要
抗生素抗性基因（ARGs）在废水环境中的传播对公共卫生构成了严重威胁。胞外 ARGs（eARGs）作为游离 DNA 片段持久存在，难以被传统的物理化学处理技术有效去除。在此，我们从市政污水中分离出斯图德氏斯图德菌（Stutzerimonas stutzeri）CHY07，并证明包括 eARGs 在内的胞外 DNA 片段可以作为环境细菌的化学引诱剂。通过基因组挖掘、分子对接、表面等离子体共振（SPR）、等温滴定量热法（ITC）和蛋白质 - 配体相互作用分析，我们确定了化学受体 Mcp16 是胞外 DNA 的主要传感器，并揭示了它实现对 DNA 磷酸骨架的非序列依赖性识别。我们进一步建立了内源性五肽 VRSVR 作为 CheR 的甲基化底物，并使用 SSB/CRISPR-Cas9 核糖核蛋白（RNP）系统构建了工程菌株 CHY07-2（mcp16::VRSVR）。该菌株表现出显著增强的趋化反应性，在非无菌污水处理厂（WWTP）二级出水中，对低分子量和高分子量 eARGs 的 72 小时去除率分别达到 96.56% 和 91.60%；相反，mcp16 缺失显著削弱了趋化性和去除率，而原位互补则恢复了它们。这些发现揭示了去除 eARGs 细菌中的“趋化 - 接触 - 去除”级联反应——并提出了一种自我强化循环——为通过靶向放大微生物趋化性来增强污染物去除提供了理论框架和技术范式。
引言
抗菌素耐药性（AMR）的全球传播是 21 世纪最具挑战性的公共卫生问题之一 [1]。抗生素抗性基因（ARGs）作为一类新的环境污染物，在水生生态系统中持续存在并广泛传播，通过水平基因转移和多药耐药病原体的出现对人类健康构成严重威胁 [2], [3]。污水处理厂（WWTPs）已被确定为 ARGs 排放到受纳水体中的主要热点，是它们环境传播的关键通道 [4], [5]。ARGs 主要以两种形式存在：存在于活细菌或死细菌细胞内的胞内 ARGs（iARGs），以及作为水相中游离 DNA 片段存在的胞外 ARGs（eARGs）[6]。其中，eARGs 因其高环境流动性、显著稳定性以及通过自然转化有效介导水平基因转移的能力而备受关注 [7]——这一特性使它们能够绕过细胞膜的通透性屏障。近期的研究进一步阐明了 eARGs 在不同废水系统中的持久性和生态风险 [8]，突显了对有效去除策略的迫切需求。
传统的废水处理和消毒技术在 eARG 去除方面存在明显局限性。氯消毒、膜过滤和紫外线照射等物理化学方法往往无法有效去除游离 DNA 片段，或者可能意外诱导细菌裂解，从而加剧 ARGs 的释放 [9], [10]。近期报道的吸附 - 催化策略，如 COF–Ti?C? 光催化，在 ARGs 降解方面显示出前景，但仍受到溶解性有机物对氧化自由基的淬灭以及可扩展材料制备和长期操作稳定性瓶颈的限制 [11]。因此，利用微生物代谢能力去除 eARGs 已成为环境修复的一个重要研究方向。在近期的研究中，Li Y. 等人 和 Dong L. 等人 分别通过分泌核酸酶的工程细菌（4 小时内去除率 >99.92%）和产生活性氧的乳酸菌 - 酵母共生体（3.2 log 去除率）证明了生物方法的潜力 [12], [13]。然而，这些策略依赖于外源酶或外来菌株介导的被动化学或酶促作用，并未解决细菌是否能通过趋化性主动感知 eARGs 的问题。细菌如何识别并主动向富含 eARGs 的微环境导航，仍然是一个关键的机制空白，严重限制了基于原生生理特性的生物强化策略的理性设计。
水生环境中的许多细菌通过分泌胞外核酸酶降解胞外 DNA 以获取营养和回收磷，表现出对低分子量（LMW）或高分子量（HMW）DNA 的优先降解 [14], [15]。然而，现有研究完全集中在被动酶促降解上，忽略了细菌可能通过趋化性感知主动定位富含 DNA 的微环境的可能性。作为细菌营养定位的基本策略，趋化性通过主动迁移克服了扩散传质限制，显著增加了细胞 - 底物 encounter 频率并加速了生物降解动力学 [16], [17], [18]。然而，化学受体的底物谱长期被认为仅限于氨基酸、糖和有机酸等低分子量营养素 [19]；大分子 DNA——特别是 eARGs 是否能被识别为化学引诱剂完全未知。证明 eARGs 作为化学引诱剂的功能将扩展细菌化学受体的已知底物范围，并为 eARGs 去除提供一种新范式：与其增强分解代谢途径（这会带来巨大的代谢负担和标记基因扩散风险），不如靶向 MCP 传感系统并通过 CheR 介导的 C 末端五肽甲基化来放大趋化反应 [20], [21]。无缝基因组编辑 [22], [23] 和 SPR/ITC 方法 [24], [25] 为受体工程和机制解析提供了必要的实验工具包。
在本研究中，我们从市政污水中分离出 S. stutzeri CHY07，并运用基因组挖掘、分子对接、SPR、ITC、PLIP 和无缝 CRISPR 编辑，系统研究了 eARGs 是否能作为一类新型细菌化学引诱剂，鉴定同源化学受体并阐明其 DNA 识别机制。在此基础上，我们筛选了一种内源性甲基化五肽（VRSVR），将其嫁接到 Mcp16 受体上，并评估了所得工程菌株 CHY07-2（mcp16::VRSVR）的增强趋化反应和 eARG 去除效率，旨在阐明“趋化 - 接触 - 去除”级联反应的运作，并为 eARGs 的高效生物去除提供实验基础。
章节片段
eARG 降解细菌的分离
污水样本采集自中国河南省的一家市政污水处理厂（WWTP）的二级生物处理单元。菌株分离使用以 eARG DNA 作为唯一碳氮源的矿物质盐培养基（MSM）；常规培养在 Luria–Bertani（LB）培养基中进行。引物、质粒和细菌菌株分别列于表 S1 和 S2 中。
eARG 底物包括四环素抗性基因 tetA（GenBank:
eARGs 是一类新型细菌趋化剂
尽管之前的调查广泛集中于 ARGs 在废水中的分布、丰度、持久性和归宿，但 eARG 降解细菌的生物资源挖掘仍相对未被充分探索 [2], [3], [7]。使用 HMW-DNA 和 LMW-DNA 作为唯一碳氮源进行富集和分离，获得了七株降解菌株（HMW 组：CHY02, CHY04, CHY06；LMW 组：CHY07, CHY11, CHY12, CHY15）。随后通过扩散平板和毛细管趋化性筛选
结论
在本研究中，我们从市政污水中分离并表征了 Stutzerimonas stutzeri CHY07，提供了证据表明包括 eARGs 在内的胞外 DNA 片段可以作为环境细菌的化学引诱剂。通过基因组挖掘、分子对接、SPR、ITC 和无缝基因组编辑，我们确定了化学受体 Mcp16 及其内源性甲基化五肽 VRSVR，并阐明了 Mcp16 实现对线性双链 DNA 的非序列依赖性识别
意义声明
本研究首次提供了证据，表明胞外抗生素抗性基因（eARGs）——一类有害环境污染物——可以被环境细菌直接识别为化学引诱剂。化学受体 Mcp16 及其对 DNA 磷酸骨架的非序列依赖性识别的鉴定，扩展了细菌化学受体的已知底物范围，并为受体工程奠定了分子基础。工程菌株 CHY07-2，
资金资助
本工作得到了河南省科技重点研发专项项目（252102320066）、开封市科技发展项目（2503017, 2403107）、河南省科技研发计划联合基金（学科类别）（252103810088）和河南省国际科技合作培育项目（262102520007）的支持。
CRediT 作者贡献声明
姚新定: 方法论，形式分析。邱留友: 写作 - 审查与编辑，写作 - 原始草稿，软件，形式分析，数据整理。朱丹: 软件，方法论。王海峰: 方法论，形式分析。杨文: 软件。郭佳祥: 写作 - 原始草稿，项目管理，数据整理。刘娟: 软件，方法论，调查。王树红: 软件，资源，形式分析。柴然: 写作 - 审查与编辑，写作 - 原始草稿，
利益冲突声明
作者声明，他们没有已知的竞争性财务利益或个人关系，可能会被认为影响了本论文中报道的工作。
柴然 | 刘娟 | 王树红 | 杨文 | 郭佳祥 | 朱丹 | 王海峰 | 姚新定 | 邱留友
中国 河南 开封 475004 黄河水利职业技术学院
