基于杂交瘤技术制备的靶向B型流感病毒血凝素160环的功能性IgM抗体

《Journal of Immunological Methods》：Hybridoma-based generation of a functional IgM antibody targeting the 160-loop of influenza B virus haemagglutinin

　　

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  小鼠以含有IBV HA 160-环区域的合成肽进行免疫。
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  从666株杂交瘤中鉴定出一株具有功能活性的IgM克隆（BHA177）。
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  BHA177 IgM抗体特异性结合HA的抗原表位。
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  BHA177 IgM对亲代IBV表现出中和活性。
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  针对IBV的IgM可能具有治疗和预防效果。

引言

目前，免疫球蛋白（Ig）G是唯一致批用于治疗用途的抗体亚型。多种针对流感病毒蛋白的单克隆抗体（MAbs）均为IgG亚型（Lu等，2020；Nakamura等，2013；Smith等，2009；Sun等，2022；Tharakaraman等，2015；Throsby等，2008）。治疗性IgG主要通过静脉给药，难以到达黏膜组织，构成重大挑战（Iwasaki，2016）；静脉给药后肺内IgG浓度比血清中低100倍以上（DeFrancesco，2020）。因此，除IgG之外的抗体亚型可能是预防感染（尤其是在黏膜部位）的有前景的候选药物。

近年来，IgM亚型作为抗病毒疗法的候选药物日益受到关注，尤其是针对2019冠状病毒病（Gasser等，2021；Hale等，2022；Ku等，2021；Liu等，2024）。IgM抗体具有十个抗原结合位点，因此比双价的IgG具有更强的凝集能力，使其能够通过形成大聚集体在黏膜表面中和病原体（Mestecky等，2015）。尽管其亲和力相对较低，IgM抗体通过多价结合实现高亲和力，增强了其对SARS-CoV-2的中和活性，并可能为多种黏膜病原体提供更广泛的保护（Wang等，2021）。评估IgM抗体的临床试验报告其免疫原性较低，支持其作为安全治疗药物的潜力（Keyt等，2020）。

获得针对特定抗原区域的IgM抗体的方法仍然具有技术挑战性。其产生受限于若干固有困难。早期产生和天然存在的IgM通常表现出对目标蛋白上多个表位的弱且广泛的反应性，阻碍了具有强区域特异性结合能力的IgM的分离。此外，加强免疫诱导的从IgM到IgG的类别转换降低了从免疫宿主中回收IgM的效率。因此，可能需要策略性的免疫方案来获得针对特定抗原区域且具有足够功能亲和力的IgM抗体。

流感B病毒（IBV）具有两种表面糖蛋白——血凝素（HA）和神经氨酸酶。HA是产生中和抗体的主要抗原蛋白。HA上的主要抗原位点包括120-环、150-环、160-环和190-螺旋（Wang等，2008）。具体而言，160-环内的氨基酸残基是决定HA抗原性的主要因素（Hovanec和Air，1984；Koel等，2013；McCullers等，1999；Nerome等，1998）。这些发现表明，靶向160-环区域的抗体可能是基于抗体的流感治疗药物的有前景的候选者。在此背景下，产生针对160-环区域的IgM抗体可能提供额外的功能优势，因为IgM抗体可能因其高亲和力而表现出更广泛的识别能力。

本研究旨在利用肽免疫产生识别IBV HA 160-环区域的IgM抗体，并评估其对IBV的功能特征。本概念验证研究的发现可能增进我们对产生针对流感病毒表位的IgM抗体的理解。

各节摘要

病毒

流感B/Iwate/34/2017、B/Iwate/1/2019（分离株获得自日本岩手县环境科学和公共卫生研究所，日本岩手县）和B/Shandong/7/97（Tsutsumi等，2006）在37 °C、5% CO₂条件下在Madin-Darby犬肾（MDCK）细胞中培养传代3-5天。收集培养上清液，使用0.45 μm滤器（密理博，美国马萨诸塞州比勒里卡）澄清，用于感染实验。制备病毒抗原时，

小鼠免疫和杂交瘤筛选

在第4、6、8、18、21和22周使用ELISA测量针对合成肽抗原的血清IgM抗体滴度（图1C）。IgM抗体滴度从第6周开始升高，随后的加强免疫进一步增强了IgM反应。在第18周（最终免疫前）和第21周（最终免疫后）测量针对肽的IgG抗体滴度（图1D）。尽管观察到一只小鼠（#4-4）的IgG滴度升高，但其余小鼠未观察到升高。

讨论

本研究评估了能否产生识别IBV HA 160-环区域的IgM抗体。我们成功获得了一株IgM抗体——命名为BHA177——具有结合和中和活性。值得注意的是，肽免疫产生了能够识别天然HA结构的有功能活性的IgM抗体。这些发现表明，基于肽的免疫可能是产生针对流感B病毒HA的功能性IgM抗体的有用策略。

在

CRediT作者贡献声明

石川静（Shizuma Ishikawa）：撰写——审阅与编辑，撰写——初稿，可视化，验证，软件，资源，项目管理，方法学，调查，形式化分析，数据整理，概念构思。小栗崇（Takashi Odagiri）：撰写——审阅与编辑，撰写——初稿，验证，项目管理，方法学，调查，资金获取，形式化分析，数据整理，概念构思。吉野直人（Naoto Yoshino）：撰写——审阅与编辑，项目管理，

作者同意声明

我们声明本手稿为原创，此前未发表，也未在其他地方接受审稿。所有作者均已阅读并批准本手稿，且所有符合作者资格的个人均已纳入。作者顺序已获所有作者批准。通讯作者将作为投稿和同行评审的主要联系人，并将处理与编辑部办公室的所有通信。

资金

本研究部分由日本学術振興会（JSPS KAKENHI）资助（项目编号 JP20K18907）和养乐多本社股份有限公司资助。

利益冲突声明

所有作者声明，他们与可能不当影响或偏袒本论文所述工作的人或组织不存在财务或个人关系。

致谢

我们感谢岩手医科大学附属医学部矢岸纯子（Sumiko Yaegashi）提供技术协助，感谢岩手医科大学附属医学部体内科学中心安穗亘（Wataru Yasuno）提供动物护理，感谢UNITECH股份有限公司（www.uniqtech.co.jp）进行了部分杂交瘤实验。我们还要感谢Editage（www.editage.jp）进行英文语言编辑。

石川静|小栗崇|吉野直人|村木泰之