《Journal of Immunological Methods》：Dynamic effects of short-term storage temperature and duration on the transcriptome and functional pathways of umbilical cord blood-derived NK cells
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摘要目的本研究旨在阐明不同储存条件（温度和时间）对脐带血（UCB）来源的自然杀伤（NK）细胞功能在转录组水平上的动态影响，为优化临床环境中脐带血采集后标准化处理方案提供理论依据。方法收集了 4 份健康的足月脐带血样本，并分为新鲜对照组（0H）和实验组，实验组分别在 4 °C（
摘要
目的
本研究旨在阐明不同储存条件（温度和时间）对脐带血（UCB）来源的自然杀伤（NK）细胞功能在转录组水平上的动态影响，为优化临床环境中脐带血采集后标准化处理方案提供理论依据。
方法
收集了 4 份健康的足月脐带血样本，并分为新鲜对照组（0H）和实验组，实验组分别在 4 °C（4C）或 25 °C（RT）下储存 24 小时（24H）和 72 小时（72H）。分离脐带血单个核细胞（CBMCs）并在体外扩增以获得 NK 细胞。利用 RNA 测序（RNA-seq）技术，结合主成分分析（PCA）、差异表达基因（DEGs）筛选、基因本体论（GO）和京都基因与基因组百科全书（KEGG）通路富集分析，全面分析了储存条件对 NK 细胞转录组的影响。
结果
结果表明，储存时间是导致转录组差异的主要因素。与 0H 组相比，储存 24 小时诱导的差异表达基因（DEGs）数量有限（24H-RT 组中仅有 11 个），表明转录组整体稳定。相比之下，储存 72 小时触发了深刻的转录组重编程，DEGs 显著富集于免疫激活相关通路。具体而言，在 72 小时时间点，与 25 °C 相比，4 °C 储存防止了如“对氧水平降低的反应”和“白细胞细胞间粘附的调节”等关键代谢通路的下调。
结论
CBMC 来源的 NK 细胞可以耐受长达 24 小时的离体储存，同时保持转录组和核心功能的稳定性。然而，将离体储存期延长至 72 小时会导致免疫和代谢相关基因表达的显著重编程。值得注意的是，在 4 °C 冷藏条件下的代谢抑制程度不如 25 °C 室温储存明显。本研究建议，脐带血的离体储存时间理想情况下应限制在 24 小时以内，室温储存是一个可行的选择。如果需要长期储存，建议采用 4 °C 冷藏。
引言
嵌合抗原受体（CAR）技术与自然杀伤（NK）细胞的结合催生了 CAR-NK 疗法，该疗法具有高度特异性和安全性。该疗法为治疗各种肿瘤（包括实体瘤）提供了一种新策略（Karamivandshi 等，2025）。作为该疗法的核心细胞来源，脐带血富含 NK 细胞——固有免疫系统的关键效应细胞。NK 细胞无需预先抗原致敏即可直接杀伤肿瘤细胞或病毒感染的细胞，且极少诱发移植物抗宿主病（GvHD）。这些独特优势为 CAR-NK 疗法的发展奠定了至关重要的基础（De Molla 等，2023）。
然而，脐带血来源的 NK 细胞在临床转化和应用方面仍面临挑战。研究表明，由于运输和处理过程中的延误，采集的血样可能会出现细胞活力下降或功能改变（Olson 等，2011）。特别是，运输或临时储存过程中常见的温度波动（例如在室温或 4 °C 下储存 24–72 小时）会影响外周血单个核细胞的产量、活力和免疫活性（Zhu 等，2018），以及脐带血 CD34+ 造血祖细胞的产量和活性（Guo 等，2021）。目前，关于短期储存条件下脐带血储存对后续 NK 细胞扩增影响的系统研究仍然稀缺，尤其是转录组水平功能变化潜在机制的深入探索。
值得注意的是，与外周血来源的 NK 细胞相比，脐带血来源的 NK 细胞表现出“更年轻”的细胞状态、更强的增殖潜力和更低的免疫原性——这些特性使它们成为异体免疫治疗的理想来源（Karamivandshi 等，2025）。采集后脐带血处理的及时性对于确保 NK 细胞质量至关重要。通过传统表型分析（如细胞计数、活力和肿瘤杀伤能力）全面评估储存条件的影响需要大量的临床样本（Guo 等，2021；Zhang 等，2015），这在实践中往往不切实际。因此，利用转录组测序技术在分子水平对有限样本进行深入分析，已成为揭示储存条件影响 NK 细胞功能机制的有效策略（Zhang 等，2021）。
在本研究中，我们模拟了脐带血在不同温度（4 °C 和 25 °C）和持续时间（24 小时和 72 小时）条件下的短期储存。使用 RNA 测序分析 NK 细胞转录组的动态变化，并结合 GO 和 KEGG 通路富集分析。旨在阐明储存条件在基因表达水平上影响 NK 细胞与免疫调节、代谢和增殖相关功能的机制。本研究的结果将为优化采集后脐带血的标准化处理程序和运输条件提供理论依据，并有助于提高脐带血资源在免疫细胞疗法中的疗效和安全性。
章节摘要
脐带血样本的采集与处理
本研究共使用了四份脐带血样本。所有样本均于 2024 年 6 月至 7 月间收集自我院妇产科。所有捐献分娩者（年龄 25–49 岁）均为足月阴道分娩，母婴健康状况良好。在样本采集前，每位分娩者均签署了用于科学研究的 《知情同意书》。采集过程严格遵循无菌操作标准，
脐带血储存样本全局转录组特征分析
为了评估不同储存条件对脐带血（UCB）来源 NK 细胞整体转录组结构的影响，本研究首先在排除非关键个体差异干扰后，分析了样本间基因表达的相关性。
结果显示，同一处理组内生物学重复样本间的相关系数均 >0.97，表明实验具有高度可重复性和一致性（图 1
讨论
在本研究中，我们通过转录组分析系统地研究了储存温度和时间对脐血来源 NK 细胞转录组的独立和交互影响。结果显示，24 小时的储存时间对 NK 细胞转录组影响有限，而储存时间延长至 72 小时触发了显著的转录重编程，表明储存时间具有关键的调控作用。这些发现提供了重要的分子依据
CRediT 作者贡献声明
Jing Xu: 软件、资源、项目管理、方法论、调查、资金获取、形式分析、数据整理、概念化。 Jing Dong: 软件、资源、项目管理、方法论、调查、资金获取、形式分析、数据整理、概念化。
利益冲突声明
作者声明，他们没有已知的竞争财务利益或个人关系，这些利益或关系可能影响本文报告的工作。
Jing Xu|Yanqin Wang|Dongmei Yang|Zehua Zhang|Li Zhang|Shanshan Xu|Jing Dong|Xuesong Gao|Chenyu Liu
