增强光动力抗菌策略：羧基化卟啉作为有效光激活光敏剂以显著降低金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的存活率

《Journal of Photochemistry and Photobiology A: Chemistry》：Enhanced photodynamic antimicrobial approach: carboxylated porphyrins as potent light-activated photosensitizers to reduce effectively viability of Staphylococcus aureus and Escherichia coli

　　

摘要翻译：
本研究首次评价了四取代硫代羧酸卟啉（H₂Pors 1–3）对金黄色葡萄球菌（*Staphylococcus aureus*）和大肠杆菌（*Escherichia coli*）的光动力灭活（PDI）效率。研究人员合成了三种分别含有巯基乙酸、3-巯基丙酸或巯基琥珀酸单元的自由基卟啉衍生物，其中H₂Por 3为新化合物，含有八个羧基。研究结果表明，在白光照射下（400–700 nm，辐照度50 mW/cm²），所有衍生物均能高效产生单线态氧（¹O₂），单线态氧量子产率（Φ_Δ）为0.43至0.63。在无碘化钾（KI）条件下，H₂Pors 1–3（1 μM）可在5–30分钟内将金黄色葡萄球菌灭活至检测限；对于大肠杆菌，单独使用H₂Pors 1–3（10 μM）在5–15分钟内未产生显著的灭活效果，但在添加100 mM碘化钾后，所有化合物均能在5–15分钟内将大肠杆菌灭活至检测限。研究还发现，H₂Pors 1–3在磷酸盐缓冲液（PBS）中表现出良好的稳定性和光稳定性，且在0.5–20.0 μM浓度范围内遵循比尔-朗伯定律，无显著聚集现象。光物理性质研究表明，荧光量子产率（Φ_F）为0.13–0.31，且取代基的数目和结构对光物理性质有显著影响。此外，与单独使用光敏剂相比，添加碘化钾显著缩短了灭活细菌所需的处理时间，这归因于单线态氧介导的碘化物氧化产生的活性碘物种（RIS）。本研究表明，多羧基卟啉衍生物，特别是与碘化钾联用时，可作为一种高效的光动力抗菌平台，具有在临床光动力治疗和环境应用中的潜力。

**论文解读：基于羧基化卟啉光敏剂的光动力抗菌策略研究**

**一、研究背景与科学问题**

抗生素的过度使用和滥用已导致多重耐药（MDR）细菌的日益增多，由耐药菌株引起的感染往往导致严重的健康问题，并常需使用可能具有潜在危害的终极抗生素。然而，许多菌株已对这些抗生素产生了耐药性。仅依赖新型抗生素的研发并非可持续的解决方案，因其最终也会不可避免地丧失疗效。因此，迫切需要探索和开发替代性治疗策略。

光动力灭活（PDI）技术作为传统抗生素治疗的 promising 替代方案，通过光敏剂（PS）、分子氧（O₂）和光的协同作用，产生活性氧物种（ROS），包括单线态氧（¹O₂）、超氧阴离子（O₂^•–）、羟基自由基（OH•）和过氧化氢（H₂O₂）。这些活性氧对细菌细胞壁、细胞质膜、胞内蛋白和脱氧核糖核酸（DNA）造成广泛非特异性损伤，因此细菌难以对PDI产生耐药性。然而，中性及阴离子光敏剂对革兰氏阴性菌的灭活效果有限，这归因于革兰氏阴性菌外膜作为额外屏障，阻碍了光敏剂与活性氧敏感分子的相互作用。近年来，研究表明无机盐如碘化钾（KI）可通过形成高毒性活性碘物种（RIS）显著增强光敏剂对革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌的灭活效果。在此背景下，本研究首次评价了四取代硫代羧酸卟啉（H₂Pors 1–3）对金黄色葡萄球菌（*Staphylococcus aureus*，革兰氏阳性菌模型）和大肠杆菌（*Escherichia coli*，革兰氏阴性菌模型）的光动力灭活效率，以确定其在临床光动力治疗和环境应用中的潜力。

**二、研究技术与方法**

本研究主要运用了以下关键技术方法：（1）有机合成方法：通过5,10,15,20-四(五氟苯基)卟啉（H₂TPPF₂₀）与硫代羧酸（巯基乙酸、3-巯基丙酸或巯基琥珀酸）的亲核取代反应，合成了三种四取代硫代羧酸卟啉衍生物H₂Pors 1–3，其中H₂Por 3为新化合物；（2）光谱表征技术：采用核磁共振波谱（NMR）、高分辨质谱（HRMS）、紫外-可见吸收光谱和荧光光谱对化合物进行结构确认和光物理性质表征；（3）单线态氧量子产率测定：以9,10-二甲基蒽（9,10-DMA）为单线态氧淬灭剂，监测其在420 nm单色光照射下的光氧化动力学；（4）稳定性与光稳定性评估：在磷酸盐缓冲液（PBS）中，分别在避光和自光照射（50 mW/cm²）条件下监测Soret带吸光度变化；（5）抗菌光动力实验：以*S. aureus*（DSM 25693，德国微生物菌种保藏中心）和基因改造的生物发光*E. coli*为模型菌株，在自光（400–700 nm）辐照度50 mW/cm²条件下进行光动力灭活实验，通过菌落计数法和生物发光检测法评估杀菌效果。

**三、研究结果**

**1. 合成与结构表征**

研究人员通过H₂TPPF₂₀与巯基琥珀酸在碳酸钾存在下于DMF中室温反应24小时，成功合成了新的八羧基卟啉衍生物H₂Por 3，产率为57.9%。核磁共振氢谱、氟谱和碳谱以及高分辨质谱均确证了四个氟原子被选择性取代的结构。H₂Pors 1和2则根据文献方法制备，分别带有四个羧基。这一结果表明H₂TPPF₂₀是快速构建硫代羧酸卟啉染料的理想平台。

**2. 光物理与光化学性质**

紫外-可见吸收光谱显示，所有化合物在413–415 nm处呈现强Soret带，在505–507 nm和580 nm处呈现中等强度的Q带。荧光光谱显示，在420 nm激发下，所有化合物在600–800 nm红光区域表现出相似的发射带，荧光量子产率（Φ_F）介于0.13至0.31之间。单线态氧产生能力研究表明，所有染料在白光照射下均为高效的¹O₂产生者，其中H₂Por 2的Φ_Δ值最高（0.63），接近参比化合物H₂TPP（0.65），优于H₂Por 1（0.49）和H₂Por 3（0.43）。这些结果表明硫代羧酸取代基的数目和结构对光物理性质具有显著影响。

**3. 稳定性与溶解度研究**

稳定性实验表明，H₂Pors 1–3在避光条件下60分钟内均表现出优异的稳定性（稳定性≥96.3%），在白光照射下也显示出良好的光稳定性（光稳定性≥87.8%）。硫代羧酸间隔基的大小和羧基数目对稳定性无显著影响。溶解度研究表明，在PBS中0.5至20.0 μM浓度范围内，Soret带吸光度与浓度呈现良好的线性关系（符合比尔-朗伯定律），表明该浓度范围内无显著聚集现象发生。

**4. 光动力灭活效果的生物学评价**

对*S. aureus*的光动力灭活实验表明，三种卟啉衍生物（1 μM）在自光照射下均表现出显著的抗菌活性（ANOVA，p<0.05）。其中H₂Por 2动力学最快，5分钟内即实现约4.5 log CFU/mL的减少；H₂Por 1在10分钟时实现7.0 log CFU/mL的急剧减少；而H₂Por 3活性相对较低，但在10分钟时仍实现了约4.5 log CFU/mL的减少。将灭活至检测限所需时间排序，H₂Por 2（5分钟）快于H₂Por 1（10分钟）和H₂Por 3（30分钟）。添加100 mM碘化钾后，所有光敏剂均在5分钟内将*S. aureus*灭活至检测限，显著缩短了处理时间。

对*E. coli*的光动力灭活实验表明，单独使用三种光敏剂（10 μM）在测试条件下均未产生显著的灭活效果（ANOVA，p>0.05），这归因于中性光敏剂与革兰氏阴性菌带负电荷外膜之间的有限相互作用。然而，添加碘化钾后，H₂Por 1、H₂Por 3和H₂Por 2分别在5、10和15分钟的照射时间（对应光剂量15、30和45 J/cm²）内将*E. coli*灭活至检测限（ANOVA，p<0.05）。光对照组和暗对照组实验证实，单独光照或光敏剂与碘化钾在避光条件下对两种细菌的存活率均无显著影响，表明观察到的抗菌效果确实源于光敏剂在光照下的协同作用。

**四、讨论与结论**

本研究表明，多羧基卟啉衍生物H₂Pors 1–3在白光照射下能高效产生单线态氧，对*S. aureus*具有显著的光动力灭活效果；尽管单独使用时对*E. coli*无效，但添加碘化钾后可实现对革兰氏阴性菌的高效灭活。值得注意的是，研究结果表明Φ_Δ并非决定PDI效率的唯一因素——尽管三种卟啉具有相似的光物理性质，但优异抗菌性能与光敏剂的结构特征密切相关。H₂Por 2中较长且更柔性的-CH₂CH₂COOH取代基提供了有利的分子构象，增强了与细菌包膜的相互作用；而H₂Por 3含有八个羧酸基团，体积较大，可能产生空间位阻效应，降低了与细菌靶标有效结合的能力。碘化钾的增效机制归因于¹O₂介导的碘化物氧化产生的活性碘物种（RIS），这些物种比¹O₂具有更长的寿命和更强的扩散能力，能更有效地渗透微生物细胞并加剧氧化损伤。然而，研究人员指出，KI浓度超过10 mM时在水生模型（*Artemia franciscana*和*Scophthalmus maximus* L.）中诱导了毒性，提示环境应用需谨慎评估。

结论部分指出，新合成的H₂Por 3通过H₂TPPF₂₀对位氟原子的选择性置换获得，与已报道的H₂Pors 1和2相比，所有染料在白光照射下均稳定且具有光稳定性，荧光量子产率较高（Φ_F=0.13–0.31），能产生单线态氧（Φ_Δ=0.43–0.63）。在碘化钾存在下，三种化合物对*S. aureus*和*E. coli*均表现出高效灭活能力（>3 log），根据美国微生物学会指南，这些光敏剂与碘化钾的联合体系可被视为有效的抗菌剂。该策略以低浓度（1–10 μM）和低光剂量即可实现两种浮游细菌的有效灭活，为其临床应用和环境消毒提供了明显优势。该论文发表在《Journal of Photochemistry and Photobiology A: Chemistry》。