3D ex vivo平台用于复发/难治性淋巴瘤患者的高通量免疫治疗筛选

《HemaSphere》：3D ex vivo platform for high-throughput immunotherapy screening in relapsed/refractory lymphoma patients

　　

复发/难治性（R/R）B细胞非霍奇金淋巴瘤（B-NHL）仍无法治愈，且缺乏可指导免疫治疗的预测性生物标志物。亟需能够忠实保留患者样本免疫背景与活性的临床前平台以开展相关高通量药物测试。研究人员在此提出一种用于免疫治疗筛选的3D ex vivo平台，其可生成患者来源淋巴瘤球体（PDLS）——一种源自患者外周血或淋巴结活检、无支架无基质的3D模型，涵盖R/R滤泡性淋巴瘤、转化型滤泡性淋巴瘤或弥漫大B细胞淋巴瘤。PDLS维持原代肿瘤的细胞组成、T细胞活化及免疫逃逸特征，支持在临床相关时间窗内对单药与联合疗法进行多重筛选。该可扩展模型重现免疫–肿瘤细胞互作，提供免疫治疗疗效的快速评估，并架起侵袭性B-NHL中临床前研究向临床应用转化的桥梁。通过整合空间图谱与单细胞RNA测序，PDLS可进一步演化为患者特异性3D肿瘤替身（avatar），支撑侵袭性B-NHL中的精准肿瘤学策略。

研究背景：B细胞非霍奇金淋巴瘤（B-NHL）含滤泡性淋巴瘤（FL）与弥漫大B细胞淋巴瘤（DLBCL）等，临床异质性强；一线抗CD20化疗免疫疗法后相当比例患者演变为复发/难治性（R/R）疾病且预后差。既有治疗（BCR通路抑制剂、BCL2抑制剂、单抗、双特异性T细胞衔接器、免疫检查点抑制剂）反应难以预测，静态批量组织分析无法捕捉肿瘤微环境（TME）中动态的免疫–肿瘤空间互作。2D培养缺失细胞–细胞/基质互作，类器官与淋巴样体等3D模型在保留自体免疫细胞与高通量扩展性上各有局限。研究人员此前建立无支架无基质的患者来源淋巴瘤球体（PDLS）体系，本研究将其升级为含R/R FL/DLBCL患者淋巴结（LN）与外周血（PB）样本、带免疫浸润注释的3D B-NHL avatar库与高通量筛选平台。

主要关键技术方法：样本来自法国图卢兹IUCT-Oncopole与美国西班牙巴塞罗那Hospital Clínic共45例R/R FL/tFL/DLBCL的LN与PB冷冻样本；解冻细胞于细胞因子富集培养基中在超低吸附96孔板经离心形成PDLS，D3给药D6读数；流式细胞术定量B细胞耗竭、T细胞亚群（CD4⁺/CD8⁺/γδ/Tfh/Tfr/Treg）、活化（CD107a）、耗竭分子（PD-1/LAG-3/TIM-3/TIGIT）与共刺激分子（CD28/4-1BB）；明场高含量成像测球体面积；Akoya Phenocycler与BOND RX多重免疫荧光（mIF）/CODEX做空间验证；Cytobank opt-SNE/UMAP/FlowSOM聚类分选T细胞meta-cluster；线性混合效应模型与Dunnett检验处理药敏数据。

研究结果：

A human viable and stable PDLS platform preserving original sample hallmarks：PDLS在D3成球、D6扩增，FL与tFL/DLBCL分别维持约65.8%与65%→56.6%活率；D0与D3免疫组成（B/CD4⁺/CD8⁺/NK/γδ T细胞）强正相关， monocytes略降；CODEX证实FL1_LN2 PDLS保留滤泡结构与Ki67⁺ B细胞空间排布，证明PDLS稳定保真原代TME。

PDLS establishment does not impair activation and exhaustion patterns of immune cells：CD4⁺/CD8⁺ T细胞上CD28、4-1BB、PD-1、TIGIT、TIM-3、LAG-3表达在D0–D3保持，LAG-3⁺ CD8⁺ T细胞比例上升但整体相关性高，说明培养不扭曲免疫活化/耗竭表型，适合T细胞免疫治疗评价。

PDLS as a platform for testing immunotherapies：在33个PDLS上试单药（αCD20-TCB/glofitamab、αCD19-CD28、αCD79b-MMAE/polatuzumab vedotin、αPD-1-TIM-3、αTIGIT、αPD-L1等）。αCD20-TCB呈剂量依赖B细胞耗竭（39–51%），伴CD107a⁺ CD4⁺/CD8⁺ T细胞上调、Granzyme B/IFNγ/TNFα升高；低CD20表达样本天然耐药；临床用过CD20×CD3双抗的三例应答患者其PDLS亦敏感，一例原发耐药者PDLS亦低响应，提示预测潜力。

Unsupervised classification of samples according to response to immunotherapies allows to highlight T-cell exhaustion profiles' discrepancies：基于B细胞耗竭层次聚类分低/中/高反应组（n=14/11/6），opt-SNE UMAP分四meta-cluster（CD4⁺耗竭/非耗竭、CD8⁺耗竭/非耗竭）；低反应组CD4⁺耗竭T细胞占比43.29% vs 高反应组19.33%，非耗竭CD8⁺ T细胞16.81% vs 29.29%，表明T细胞耗竭谱驱动疗效差异。

Predictive relevance of PDLS responses relative to clinical data：配对LN/PB显示组织来源不影响整体反应；同患者二线后复发LN（FL1_LN2）比初诊LN（FL1_LN1）对αCD20-TCB敏感性下降，重现临床耐药演变；4例临床双抗治疗反应与PDLS ex vivo耗竭率一致。

A platform able to unveil the effects of multiple immunotherapy combinations' screening：每样本测至多60组合，αCD20-TCB+αTIGIT或+αPD-1-TIM-3显著提升耗竭（EE最高68.26%），但低反应组联合亦难逆转；单用ICP抑制剂活性弱，具免疫调节而非直接杀伤特征。

讨论与结论翻译：研究人员指出该ex vivo B-NHL平台填补R/R FL/DLBCL功能药筛与应答生物标志物发现空白，较2D共培养及其他3D模型同时在自体免疫保留、短时读数、高通量上占优。局限包括解离冻存损 stromal 成分、每孔需5万细胞、ABC-DLBCL球体脆性、不能捕捉慢性耐药重塑。结论：PDLS平台在ex vivo忠实捕获患者特异性免疫–肿瘤互作与治疗应答，是侵袭性淋巴瘤临床前评价进展；其易部署于具备流式设备的多中心，可并入SMARTrial（NCT03488641）等临床试验，联合CODEX与scRNA-seq可提炼预测签名，未来前瞻流程可在疗前测PDLS、关联临床结局以指导个性化用药。

发表于《HemaSphere》。