《Materials & Design》：Multifunctional ZnO nanoflower-integrated supramolecular dual-network hydrogel to remodel regeneration microenvironment for infected wound healing
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皮肤作为人体主要物理屏障，其结构完整性对于抵御病原体入侵和维持内部稳态至关重要。然而，由严重创伤、深度烧伤、糖尿病或长期卧床引起的慢性皮肤缺损仍是全球范围内的重大临床挑战[1]–[6]。与急性伤口不同，慢性伤口常陷入由持续微生物感染、过度氧化应激和炎症调控失调
皮肤作为人体主要物理屏障，其结构完整性对于抵御病原体入侵和维持内部稳态至关重要。然而，由严重创伤、深度烧伤、糖尿病或长期卧床引起的慢性皮肤缺损仍是全球范围内的重大临床挑战[1]–[6]。与急性伤口不同，慢性伤口常陷入由持续微生物感染、过度氧化应激和炎症调控失调驱动的自我延续性病理循环，最终导致修复延迟或停滞[7]，[8]。在这些因素中，细菌感染尤为有害，耐药病原体特别是耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）可促进生物膜形成，维持炎症激活，并降低常规抗生素疗法的疗效[9]–[11]。同时，过量的活性氧（ROS）积累和以M1型巨噬细胞为主的持续炎症进一步损伤细胞外基质及周围活力细胞[12]，[13]。这些不利变化阻碍了向血管生成、组织重塑和功能性伤口闭合的转变。因此，感染伤口需要不仅提供伤口覆盖，还能主动调控感染、氧化应激和炎症以创造有利于再生的微环境的治疗性敷料。
水凝胶因其能够维持湿性愈合环境、吸收渗出液并为伤口缺损提供物理覆盖而被广泛探索作为伤口敷料[14]，[15]。然而，大多数传统水凝胶在很大程度上仍是被动性的，缺乏主动调控以感染、氧化应激和炎症为主导的伤口微环境的能力。为克服这一局限，生物活性水凝胶敷料日益被开发用于将物理伤口保护与局部微环境调控相结合[16]，[17]。近期研究表明，先进水凝胶敷料能够协调细胞反应与动态伤口微环境调控，并整合生物活性天然化合物以提供抗菌和再生功能[18]，[19]。甘草酸（GA）是甘草的主要生物活性成分，具有充分记载的抗炎和抗氧化活性[20]，[21]。在本研究中，研究人员引入GA既作为治疗调节因子又作为超分子构建单元。通过利用GA驱动的自组装，构建了动态超分子水凝胶网络，赋予敷料可注射加工性和贴合缺损的适应性，实现对不规则伤口空间的原位填充。然而，仅由可逆非共价相互作用维持的单一超分子网络在持续生理运动和外部机械扰动下可能提供不足的机械稳健性[22]，[23]。为解决此问题，研究人员假设引入第二个更稳定的共价网络可以增强超分子骨架同时保持其动态适应性。选择甲基丙烯酰化明胶（GelMA）是因为其良好的生物相容性、光交联性和可调机械性能[24]。经紫外光照射后，GelMA在GA物理网络内光交联形成互穿共价网络，最终形成超分子双网络水凝胶。
然而，仅GA介导的抗氧化和免疫调节作用可能不足以控制持续性细菌感染，这凸显了将有效抗菌组分整合进水凝胶系统的必要性。锌是参与维持皮肤稳态的必需微量元素，并参与多种与伤口修复相关的生物过程，包括细胞增殖、转录调控和DNA修复。氧化锌（ZnO）被美国食品药品监督管理局认定为一般认为安全（GRAS），因其固有的抗菌和抗炎活性、良好的生物相容性及再生潜力而受到广泛关注[25]，[26]。据报道，在适当浓度下，含ZnO的伤口敷料可促进内皮细胞增殖、血管生成和组织再生，同时降低细菌感染和过度炎症的风险。近期研究已证明ZnO纳米结构对临床相关病原体（包括MRSA）具有广谱抗菌和抗生物膜活性[27]，支持其在感染伤口管理中的潜在应用。ZnO的抗菌活性主要与直接接触介导的膜破坏和Zn2?诱导的细菌损伤有关[28]，[29]。然而，传统ZnO基材料常表现出有限的抗菌效力，而过量Zn2?暴露可能对周围哺乳动物细胞产生不利影响，表明ZnO的治疗效果强烈依赖于其浓度、形态和制剂[30]。先前研究表明，花状ZnO结构比传统ZnO形态表现出更强的抗菌活性，可能归因于其分级结构、增大的表面积和丰富暴露的活性界面[31]，[32]。因此，本研究将ZnO设计为分级纳米花并掺入超分子双网络水凝胶中，以增强细菌接触和抗菌活性，同时提供局部治疗并支持有利于再生的伤口微环境。
在此，研究人员设计了ZNFs@GA/GelMA，一种用于感染伤口综合治疗的多功能超分子双网络水凝胶。该水凝胶通过有序分步网络构建策略制备，该策略将GA驱动的超分子自组装与光引发甲基丙烯酰化明胶（GelMA）聚合相结合。第一步，GA自组装建立动态物理网络，提供可注射加工性和贴合缺损的适应性，同时作为具有抗炎和抗氧化功能的生物活性组分。第二步，GelMA光交联形成与初级物理网络互穿的次级化学网络，赋予显著提高的机械强度和结构稳定性，从而延长伤口滞留时间并实现ZNFs的稳定掺入（方案1）。掺入的ZNFs的固有抗菌活性与水凝胶基质的抗菌功能互补，共同实现对代表性细菌病原体的有效抑制。同时，该水凝胶系统通过减少过量ROS积累、减弱M1相关巨噬细胞活化以及促进巨噬细胞向促修复性M2表型复极化，减轻氧化应激并重塑炎症微环境。总体而言，该水凝胶平台协调抗菌防御、氧化还原稳态和免疫重塑，将不利的伤口微环境转向有利于再生的状态，从而支持血管生成、组织重塑和加速伤口闭合。
论文解读：多功能ZnO纳米花集成超分子双网络水凝胶促进感染伤口愈合的研究
一、研究背景与问题
皮肤是人体最重要的物理屏障之一，其结构完整性的维持对于防止病原体入侵和保持内部稳态至关重要。然而，由严重创伤、深度烧伤、糖尿病或长期卧床等因素导致的慢性皮肤缺损仍然是全球性的重大临床挑战。与急性伤口不同，慢性伤口通常陷入由持续微生物感染、过量氧化应激和炎症调控紊乱共同驱动的自我延续性病理循环，最终导致修复延迟甚至停滞。其中，细菌感染尤为关键，耐药性病原体特别是耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（Methicillin-resistant Staphylococcus aureus, MRSA）可促进生物膜形成、维持炎症激活并降低常规抗生素治疗的疗效。与此同时，过量活性氧（Reactive Oxygen Species, ROS）的积累以及以M1型巨噬细胞为主的持续性炎症会进一步损伤细胞外基质和周围存活细胞。这些不利变化阻碍了伤口向血管生成、组织重塑和功能性闭合阶段的转变。因此，感染伤口迫切需要不仅能提供物理覆盖，还能主动调控感染、氧化应激和炎症微环境的治疗性敷料。
水凝胶因其能维持湿性愈合环境、吸收渗出液并提供物理覆盖而被广泛研究。然而，大多数传统水凝胶仍较为被动，缺乏主动调控感染、氧化应激和炎症主导的伤口微环境的能力。为克服这一局限性，研究者致力于开发能够将物理伤口保护与局部微环境调控相结合的生物活性水凝胶敷料。甘草酸（Glycyrrhizic acid, GA）作为甘草的主要生物活性成分，具有明确的抗炎和抗氧化活性，本研究将其同时用作治疗调节因子和超分子构建单元。然而，仅由可逆非共价相互作用维持的单一超分子网络在持续生理运动和外部机械扰动下可能力学性能不足。为此，研究人员引入甲基丙烯酰化明胶（Gelatin methacryloyl, GelMA）作为第二共价网络，通过紫外光交联与GA物理网络形成互穿双网络结构。此外，考虑到GA介导的抗氧化和免疫调节作用可能不足以控制持续性细菌感染，研究进一步将氧化锌（Zinc oxide, ZnO）设计为分级纳米花结构（ZnO nanoflowers, ZNFs）掺入水凝胶系统，利用其固有的抗菌活性和再生潜力实现对感染伤口的综合治疗。
二、研究内容与结论
研究人员设计并制备了ZNFs@GA/GelMA多功能超分子双网络水凝胶，用于感染伤口的综合治疗。该水凝胶通过有序分步网络构建策略制备：首先利用GA的超分子自组装形成动态物理网络，赋予水凝胶可注射性和贴合不规则创面的适应性；随后通过紫外光引发GelMA光交联形成与物理网络互穿的共价网络，显著提高水凝胶的机械强度和结构稳定性。体外实验表明，ZNFs的掺入显著增强了水凝胶对MRSA和大肠杆菌（E. coli）的抗菌活性；含GA的水凝胶可清除过量ROS，抑制M1型巨噬细胞相关炎症活化，并促进巨噬细胞向促修复性M2表型极化。水凝胶还支持内皮细胞迁移、VEGF-A表达和毛细管样网络形成。在MRSA感染的大鼠全层皮肤缺损模型中，ZNFs@GA/GelMA有效降低细菌负荷和炎症反应，促进血管生成和组织重塑，加速伤口闭合。该超分子双网络水凝胶集物理适应性、抗菌活性、免疫调节和促再生支持于一体，为感染伤口的管理提供了一种有前景的敷料策略。
三、主要关键技术方法
本研究采用的主要关键技术方法包括：水热法合成ZnO纳米花（ZNFs）；利用GA超分子自组装与GelMA紫外光交联的有序分步策略构建双网络水凝胶；扫描电子显微镜（SEM）、透射电子显微镜（TEM）、傅里叶变换红外光谱（FTIR）和能量色散X射线光谱（EDS）进行材料表征；动态光散射（DLS）测定粒径分布；流变学测试和压缩测试评估力学性能；分子动力学（MD）模拟揭示GA自组装机制；体外抗菌实验、细胞内ROS检测、巨噬细胞极化分析（免疫荧光染色和流式细胞术）、ELISA细胞因子检测、内皮细胞迁移和管形成实验评估体外生物学效应；建立MRSA感染的SD大鼠全层皮肤缺损模型进行体内治疗效果评价。动物实验经华中科技大学实验动物中心伦理委员会批准（批准号：2025-4837）。
四、研究结果
（一）ZNFs@GA/GelMA水凝胶的制备与表征
通过有序分步交联策略成功制备了ZNFs@GA/GelMA超分子双网络水凝胶。SEM显示ZNFs呈现由纳米片组装而成的花状结构，DLS测得其平均水合粒径约为1163 nm。宏观观察表明GA/GelMA和ZNFs@GA/GelMA均能形成具有自支撑能力的白色固态凝胶。TEM显示GA凝胶基质由致密交织的针状纤维组成，SEM进一步证实冻干水凝胶具有互连的三维多孔结构。EDS元素分布图证实Zn信号均匀分布于整个水凝胶网络中，FTIR光谱确认了复合水凝胶的成功形成。这些结果表明ZNFs@GA/GelMA兼具结构稳定性和ZNFs的均匀固定能力。
（二）可注射性与分子动力学模拟
非光交联的ZNFs@GA/GelMA前体水凝胶可通过注射器顺畅挤出为连续纤维，表明其适用于微创递送和原位缺损填充。流变学分析显示，前体水凝胶的储能模量（G′）迅速超过损耗模量（G″）并在整个频率范围内保持优势，证实GA自组装已形成具有凝胶状粘弹行为的物理交联网络。紫外光照射后，水凝胶保持自支撑和形状稳定结构，确认双网络水凝胶成功形成。压缩测试表明GA/GelMA较纯GelMA具有更高的压缩模量，且ZNFs的掺入不损害双网络的力学增强效应。溶胀实验显示水凝胶在48小时内逐渐达到溶胀平衡。MD模拟揭示GA分子在水溶液中通过分子间氢键和疏水相互作用自发组装为稳定的超分子聚集体，均方根偏差（RMSD）、溶剂可及表面积（SASA）、氢键数和回转半径（Rg）等参数在模拟期间趋于稳定，为GA介导的可逆物理交联提供了分子水平证据。
（三）抗菌活性与ROS清除能力
采用平板计数法评估水凝胶对MRSA和E. coli的杀菌性能。结果显示，PBS、GelMA和GA/GelMA组观察到密集的细菌菌落，而ZNFs@GA/GelMA组表现出显著强于ZNFs@GelMA和GA/GelMA组的抑菌效果，证明ZNFs与GA的协同掺入赋予水凝胶更强的广谱抗菌活性。Zn2?释放实验证实水凝胶在pH 5.5和7.0条件下均能持续释放Zn2?。在细胞水平上，利用LPS刺激RAW 264.7巨噬细胞建立氧化应激模型后，DCFH-DA荧光染色和流式细胞术分析均显示ZNFs@GA/GelMA处理显著降低细胞内ROS水平，表明水凝胶具有有效的抗氧化活性。
（四）免疫调节作用
在LPS诱导的炎症模型中，免疫荧光染色显示水凝胶处理后M1标志物iNOS表达呈阶梯式下降，而M2标志物Arg-1表达相应上调，其中ZNFs@GA/GelMA组效果最显著。ELISA结果显示，水凝胶处理显著降低促炎细胞因子TNF-α分泌，同时增加抗炎细胞因子IL-10分泌。流式细胞术分析进一步证实，ZNFs@GA/GelMA组CD86阳性（M1）巨噬细胞比例最低，而CD206阳性（M2）巨噬细胞比例最高，证明该水凝胶能有效驱动巨噬细胞从促炎性M1表型向修复性M2表型复极化。
（五）促进血管化
采用Transwell迁移实验评估水凝胶对内皮细胞迁移的影响，结果显示ZNFs@GA/GelMA条件培养基显著增强人脐静脉内皮细胞（HUVECs）的定向迁移。免疫荧光染色表明水凝胶处理上调HUVECs中VEGF-A的表达。管形成实验进一步证实，ZNFs@GA/GelMA处理的HUVECs形成更连续、分支更多的毛细管样网络结构。这些结果表明水凝胶通过增强VEGF-A表达、内皮细胞迁移和毛细管样网络形成，提供了支持血管生成的良好微环境。
（六）加速感染伤口愈合
在MRSA感染的SD大鼠全层皮肤缺损模型中，ZNFs@GA/GelMA组在伤后第6天即表现出明显更小的残余创面面积，第9天接近完全闭合。伤口组织的活/死细菌染色和菌落计数显示，ZNFs@GA/GelMA处理显著增加细菌死亡比例，有效控制伤口感染。H&E染色显示该组再生组织具有更完整的组织架构，表现为连续再生的上皮层、改善的真皮组织和减少的炎症细胞浸润。Masson染色结果表明ZNFs@GA/GelMA处理减轻了过度的胶原沉积，有利于更佳的结构修复。
（七）体内免疫调节作用
对再生伤口组织进行iNOS和CD206免疫荧光双染，结果显示PBS和GelMA组呈现强iNOS阳性信号和相对较弱的CD206染色，而ZNFs@GA/GelMA组iNOS信号最低、CD206信号最高，证实该水凝胶在体内也能有效重塑免疫微环境，促进巨噬细胞向M2表型偏移。CD31和α-SMA双染结果显示，ZNFs@GA/GelMA组具有最丰富的CD31阳性微血管和增强的α-SMA阳性覆盖，表明其促进新血管形成和血管成熟。
（八）生物相容性与生物安全性
体外溶血实验显示所有水凝胶组的溶血率均远低于5%的安全阈值。Calcein-AM/PI活/死染色和CCK-8实验证实水凝胶对RAW 264.7巨噬细胞和HUVECs均无明显的细胞毒性，细胞活力维持在90%以上。体内主要器官（心、肝、脾、肺、肾）的H&E染色未观察到明显的组织损伤、炎症浸润、坏死或纤维化，证实ZNFs@GA/GelMA具有良好的体内生物安全性。
五、总结与讨论
综上所述，本研究成功制备了ZNFs@GA/GelMA多功能超分子双网络水凝胶敷料用于感染伤口修复。讨论部分强调，传统的单一网络水凝胶难以同时满足感染伤口对机械稳定性、可注射性和生物活性等多重要求。本研究通过"物理超分子网络+共价网络"的双网络设计策略，实现了水凝胶力学性能与动态适应性的协同优化。GA驱动的超分子自组装不仅赋予水凝胶可注射性，还提供了抗炎和抗氧化功能；而GelMA光交联网络则确保了结构稳定性和伤口滞留能力。ZNFs的引入弥补了单一组分抗菌能力不足的缺陷，其花状分级结构增强了细菌接触和抗菌效果。更重要的是，该水凝胶系统通过清除过量ROS、抑制M1型炎症和促进M2型修复性极化，建立了有利于再生的免疫微环境，进而支持血管生成和组织重塑。体内外实验共同证实了这一多机制协同治疗策略的有效性。
研究结论部分指出，研究人员成功制备了用于感染伤口修复的多功能超分子双网络水凝胶敷料ZNFs@GA/GelMA。GA介导的第一网络水凝胶表现出良好的可注射性和贴合适应性，能够有效填充不规则伤口缺损。紫外光交联后，GelMA共价网络进一步增强水凝胶并提供稳定的伤口界面覆盖。体外实验表明，ZNFs的掺入显著增强了水凝胶对MRSA和E. coli的抗菌活性。同时，含GA的水凝胶减少了过量ROS积累，抑制了M1相关炎症活化，并促进巨噬细胞向促修复性M2表型极化。该水凝胶还支持内皮细胞迁移、VEGF-A表达和毛细管样网络形成。在感染伤口模型中，ZNFs@GA/GelMA有效降低了细菌负荷和炎症反应，促进了血管生成和组织重塑，并加速了伤口闭合。总之，该超分子双网络水凝胶整合了物理适应性、抗菌活性、免疫调节和促再生支持功能，为感染伤口的管理提供了一种有前景的敷料策略。
