《Developmental Dynamics》：Membrane lipid metabolism as a regulatory frontier in neural crest biology: Roles for sphingolipids, cholesterol, and lipid rafts
神经嵴细胞（Neural crest cells, NC cells）是多能、迁移性的干细胞样细胞，对于脊椎动物发育至关重要，广泛贡献于包括颅面骨骼、外周神经系统和色素生成细胞在内的多种组织。它们的发育经历诱导（induction）、特化（specification）、分层（delamination）、迁移（migration）和分化（differentiation）等阶段。重要的是，通过这些阶段的进展需要质膜（plasma membrane）来检测和响应细胞外信号。虽然调控神经嵴发育的基因调控网络（gene regulatory networks）和信号已被充分表征，但质膜脂质组成作为控制这些转变的调控层仍未被充分探索。尽管在定量测量脊椎动物胚胎中的脂质方面存在技术限制，但遗传和分子研究已推断出关键脂质代谢物的作用。在此，我们综述了膜脂代谢和组成如何调控神经嵴行为，主要聚焦于鞘脂（sphingolipids）、胆固醇（cholesterol）和脂筏结构域（lipid raft domains）。我们研究了形态发生素信号如何被脂质修饰和组织，调节脂质含量如何改变神经嵴质膜的生物物理状态，以及脂质代谢失调在神经嵴病（neurocristopathies）中的有害影响。通过借鉴其他发育和疾病背景，我们强调膜脂代谢是神经嵴生物学中的一个关键前沿，对理解发育机制和先天性疾病具有广泛意义。
1 引言
神经嵴细胞（NC cells）是多能、迁移性的干细胞样细胞，对脊椎动物发育至关重要，并贡献于多种系统。NC细胞与头部的感觉基板（sensory placodes）一起，产生支配身体的感觉神经节和自主神经节的神经元和支持性胶质细胞。此外，尽管起源于外胚层，NC以其显著的多能性而闻名，一些细胞分化为更中胚层样的衍生物，包括颅面骨骼的软骨细胞和成骨细胞、分隔心脏流出道（cardiac outflow tract）的平滑肌、皮肤中的色素细胞以及肾上腺的嗜铬细胞。这种独特的潜力和NC对脊椎动物发育和进化的显著贡献，一个多世纪以来一直吸引着发育生物学家的关注，但我们对NC细胞适当行为如何实现的理解中仍存在新的前沿。
NC细胞经历多次发育转变，依次通过诱导、特化、分层、迁移和分化阶段。重要的是，每个阶段都以来自周围环境的化学和机械信号为标志，这些信号必须通过质膜被感知和转导。NC细胞首先在原肠胚形成（gastrulation）期间，在一组称为神经板边界（neural plate border）的前体细胞带中被诱导，该边界位于内侧神经板（neural plate）和外侧外胚层之间。在神经胚形成（neurulation）期间，神经板折叠成管状并将NC定位于背侧中线，此时NC变得特化。然后它们经历上皮-间充质转化（epithelial-to-mesenchymal transition, EMT），从神经上皮分层，并开始脊椎动物胚胎中最长的迁移之一。NC细胞的命运在迁移过程中逐渐偏向并确定，之后它们分化成最终细胞类型的广泛阵列。虽然NC细胞表现出的具体解剖结构、时间和分化能力在不同物种之间以及沿前-后轴的精确水平上略有不同，但这些总体阶段及其发育背后的核心基因调控相互作用是高度保守的。这个复杂的基因调控网络在诱导期间启动，虽然每个模块都为推进NC状态到发育的下一阶段提供转录输入，但这些网络也由细胞和组织水平的相互作用激活和加强。
自19世纪中后期首次描述以来，大量工作已经定义了NC细胞产生的衍生物、使其非凡行为成为可能的遗传、表观遗传和信号景观，以及NC发育的破坏如何产生统称为神经嵴病（neurocristopathies）的广泛先天异常。尽管有这段丰富的研究历史，但NC生物学的许多方面尚未以同样的深度进行探究。为了填补这些知识空白，该领域越来越多的关注现在转向转录后和翻译后调控、营养代谢和可用性、生物物理力以及脂质代谢的物理化学影响，作为NC发育过程中起作用的调控关键层。由于NC发育的每一步都由环境中被质膜检测到的化学或机械线索协调，该膜必须有能力以适当的时机和强度接收和响应这些信号。虽然这部分是通过信号配体和受体的差异表达实现的，但越来越多的证据表明，发育时序性的膜脂代谢是重要的发育调控因子。脂质代谢是一个广泛的话题，涵盖数百种不同的脂质种类，并与细胞生理学的众多方面相交；为清晰起见，我们将专注于质膜富集的脂质种类，主要是鞘脂和胆固醇，它们共同是膜组织、生物物理特性的重要调控因子，并产生生物活性信号分子。
在这篇综述中，我们将主要关注鞘脂和胆固醇代谢物如何在NC发育过程中发挥重要功能。我们将首先广泛概述这些脂质类别及其在膜生物学中的已知主要功能。然后，我们将带领读者了解NC发育的步骤，从诱导和特化到最终分化。我们将展示膜脂质含量和组织在每个阶段如何发挥作用的证据，特别关注脂质化如何影响在NC发育中起主要作用的形态发生素，以及不同质膜脂质含量所带来的生物物理变化。我们将与更广泛的发育和疾病背景中确定的原则进行类比，并讨论脂质代谢的破坏如何导致神经嵴病。需要指出的是，由于尚未在NC发育过程中全面测量和分析特定的脂质组成，这些脂质的作用主要是从针对所需酶或蛋白质脂质化位点的遗传和分子研究中推断出来的。最后，我们将描述关键的知识空白，并提出利用尖端脂质组学技术的未来方向。
2 鞘脂和胆固醇是必需的质膜组织者
质膜由脂质双层及其相关的跨膜和膜相关蛋白组成。该双层作为细胞与细胞外环境之间的物理屏障，是发育信号被识别和转导的地方，并作为招募和组织必要信号蛋白的支架。质膜的脂质组成决定了其生物物理特性，如膜流动性（membrane fluidity）、有序性（order）、曲率（curvature）和厚度（thickness），这些反过来又调控蛋白质的组织和活性，并最终决定细胞行为。
2.1 主要的膜脂类别
主要的膜脂类别包括甘油磷脂（glycerophospholipids）（如磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰丝氨酸和磷脂酰肌醇）、鞘脂（如鞘磷脂、神经酰胺和糖鞘脂）以及甾醇（动物细胞中主要为胆固醇）。虽然这些脂质在双层中发挥重要的结构作用，但它们也在细胞信号网络中发挥重要作用。其中被广泛认知的，磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）磷酸化磷脂酰肌醇-4,5-二磷酸（PIP2）产生磷脂酰肌醇-3,4,5-三磷酸（PIP3）；这招募膜相关信号蛋白，并在NC形成、迁移和形态发生中具有明确的作用。由于鞘脂和胆固醇在调控膜中的细胞信号传导和生物物理相互作用方面发挥各自的作用，这里我们将重点关注它们的代谢如何调控膜组织并控制NC行为。
鞘脂由鞘氨醇碱基骨架组成，具有可变的头基和两个通常高度饱和且刚性的、衍生自脂肪酸的酰基链。神经酰胺处于鞘脂多样性的中心，且 largely 非极性，仅有一个小的羟基头基；通过鞘磷脂合酶可逆地添加一个更极性的磷酸胆碱头基产生鞘磷脂，而添加其他头基则产生额外的脂质家族，如糖鞘脂。鞘脂的从头合成始于内质网中神经酰胺合酶产生神经酰胺；然后神经酰胺被转运至高尔基体，由鞘磷脂合酶产生鞘磷脂。鞘磷脂易于转运至质膜，细胞约90%的鞘磷脂含量位于质膜，主要在外层叶。尽管其最初在内质网/高尔基体中合成，这些鞘脂可以在包括质膜在内的其他双层中进行额外的代谢相互转化。例如，中性和酸性鞘磷脂酶分别在水解鞘磷脂的磷酸胆碱头基，在内层和外层质膜叶产生神经酰胺。这些机制使得能够响应环境线索对膜特性进行空间限制的重塑。
除了在膜结构中的结构作用外，鞘脂含量的微小变化可以对细胞生理学产生重大影响，神经酰胺积累与细胞凋亡、分化和细胞极性有关。另一方面，鞘磷脂通常与膜内的胆固醇形成复合物，并参与形成称为脂筏的瞬时信号平台；饱和酰基链和胆固醇的局部富集也有助于紧密的脂质堆积和局部膜刚性。此外，膜曲率受到单个脂质几何形状的强烈影响；例如，神经酰胺相对于其酰基链的小头基形成促进负膜曲率的锥形形状，而鞘磷脂较大的磷酸胆碱头基形成更圆柱形的形状，有利于更平坦的膜结构。
2.2 膜脂组成决定其生物物理特性
甾醇、鞘脂和甘油磷脂的结构特征直接影响膜生物物理特性。膜流动性是脂质双层的固有特征，由磷脂链长度、饱和状态以及胆固醇等分子的存在决定，并调控膜相关分子的侧向扩散速率。疏水性酰基链长度及其饱和程度决定了脂质堆积和流动性的几何形状和程度：不饱和酰基链含有引入扭结的双键，阻止紧密堆积并促进更松散的堆积和更流动、局部膜无序；相反，高度饱和的酰基链促进更紧密的脂质堆积，导致更刚性、有序的膜。胆固醇填充双层中的空间，提供额外的局部有序性和刚性，自由存在或通过氢键与鞘磷脂复合。这些特性通常使用多种生物物理敏感的显微镜技术测量。
脂质结构和堆积的这些差异也产生局部膜异质性。脂质-脂质和脂质-蛋白质相互作用驱动膜平面内瞬态、功能性相分离的纳米结构域，通常称为脂筏。这些结构域富含鞘磷脂等饱和脂质并含有胆固醇，形成增加膜有序性和刚性的斑块，集中信号蛋白从而实现从细胞表面到内部的选择性和有效信号转导。这些平台中局部蛋白质浓度增加和扩散速率降低使受体和下游效应物稳定接近以促进信号激活，同时排除负调控因子如跨膜磷酸酶。信号蛋白向这些筏结构域的瞬时定位通常由翻译后脂质化调控，即疏水代谢物在定义位置共价连接至蛋白质。糖磷脂酰肌醇（GPI）锚或长链饱和酰基如肉豆蔻酰或棕榈酰部分的脂质化分别促进向外层和内层脂筏结构域的分配，而添加较短、分支的异戊二烯基团导致远离筏的膜定位。这是因为饱和酰基链优先与筏中有序、紧密堆积的脂质结合，而庞大的分支异戊二烯化不能在这些结构域内有效堆积。许多下游转导激酶是脂质化的，如双重棕榈酰化和肉豆蔻酰化的SRC家族激酶LYN和FYN，它们与上游受体复合物一起被招募到筏中，从而调节对表面受体-配体相互作用的细胞内信号反应。这些依赖脂质化的定位机制在胚胎发育过程中尤为关键，其中形态发生素及其受体利用脂质修饰和筏分配来建立精确的信号输出，从而模式化包括NC在内的组织。
2.3 神经嵴发育过程中的动态脂质重塑仍未充分探索
使用经典胚胎学分子技术研究脂质一直很困难，限制了我们对它们在发育中作用的理解。脂质组学技术的最新进展，特别是高灵敏度质谱法，已开始表征细胞脂质组的显著多样性。然而，直接在活体完整细胞中测量膜脂质含量在技术上仍具挑战性，我们仍然缺乏整个发育过程中脂质调控的高时空分辨率图像，使其成为细胞和发育生物学家特别令人兴奋的前沿。最近的研究结果表明，随着诱导多能干细胞（iPSCs）分化为NC，脂质状态发生深刻变化，在此转变过程中膜脂质有序性显著增加，由单不饱和脂肪酸合成酶表达增加驱动。此外，我们最近的工作表明，鞘脂代谢由NC基因调控网络通过SOX10依赖的鞘磷脂酶表达控制进行主动调控。在以下部分，我们将研究形态发生素途径脂质化和脂质依赖性膜组织如何可能调控NC诱导和特化，鞘脂代谢如何重塑膜以启用分层和迁移，以及生物活性脂质如何控制NC存活和分化。
3 脂筏组装和形态发生素脂质化在NC诱导和特化期间空间组织信号
NC诱导需要多种形态发生素途径的精心协调信号，其中 notable 的是WNT、骨形态发生蛋白（BMP）和成纤维细胞生长因子（FGF）途径。在原肠胚形成期间，这些形态发生素激活一组转录因子，包括PAX3/7、ZIC1和MSX1/2，它们构成神经板边界基因调控模块；这些转录因子在神经胚形成期间的持续表达与经典WNT信号传导相结合，以前馈机制推进基因调控网络表达NC特化标记物SOX9、FOXD3和SNAIL。通过结合响应细胞表面的跨膜受体，此类形态发生素建立相交的梯度，模式化早期胚胎组织；因此，增加或减少任何这些途径的活性对NC细胞群的诱导和特化都有不利影响。因为指定NC的形态发生素必须跨质膜转导以激活基因调控网络，塑造跨细胞表面局部膜组成和组织的机制对于信号调控尤为重要。此类机制包括促进蛋白质与质膜的相互作用或将信号蛋白分配到脂筏中，特别是通过翻译后脂质化。由于这些形态发生素途径各自调控其激活下游的转录因子，质膜处其活性的细微失调可诱导深远影响并使多个基因靶标失调。
3.1 WNT信号传导
膜内的脂质动力学可以微调信号传导过程，因为疏水相互作用有助于将膜上的相互作用定位到其适当的区室。WNT信号传导是这方面的一个典型例子，其中WNT配体结合并使它们的受体Frizzled与低密度脂蛋白相关受体5和6（LRP5/6）共受体在表面质膜二聚化；它们的相互作用导致β-连环蛋白（β-catenin）蛋白水平的去抑制，这种稳定的β-连环蛋白可以转位到细胞核以激活后续基因表达变化。WNT信号传导对适当的NC发育至关重要，与许多其他蛋白质一样，WNT经历可逆的棕榈酰化，从而增加其疏水性并有利于膜相互作用，这是WNT信号活性所必需的。WNTs在内质网中被O-乙酰转移酶Porcupine棕榈酰化，然后由蛋白质Wntless转运至质膜，NC细胞中Porcupine缺陷的小鼠模型显示包括口面裂在内的颅面异常。虽然这些表型表明对后期NC发育而非诱导或特化的干扰，但它们是使用Wnt1-Cre条件性敲除小鼠模型鉴定的，该模型在NC特化后发挥作用。这一时间限制妨碍了就WNT棕榈酰化在NC特化期间的需求得出确切结论，将需要未来使用更早期NC驱动因子的实验。
WNT突变体棕榈酰化缺陷更广泛地表明，这种酰化使WNT配体定位到去污剂抗性膜部分（即脂筏）；这种定位是受体复合物结合所必需的，其缺失会减弱下游β-连环蛋白稳定化。有趣的是，在斑马鱼中，WNT信号调控因子Lypd6也通过其GPI锚被招募到脂筏中，在那里它确保WNT依赖的Lrp6磷酸化特异性地在筏结构域中发生。Lypd6缺失或从脂筏中错误定位导致非筏膜结构域中Lrp6磷酸化异常和WNT信号活性降低，从而错误调控斑马鱼早期中胚层和神经外胚层模式。此外，胆固醇富集在包含Frizzled和LRP6的WNT信号复合物周围的膜区域，通过其PDZ结构域的胆固醇结合将支架蛋白Dishevelled招募到这些复合物。这种结合对NC细胞形成至关重要。使用非洲爪蟾胚胎中的吗啉代寡核苷酸介导的敲低，Sheng等人表明野生型Dishevelled-2可以挽救Dishevelled吗啉代突变体中的Twist表达；然而，胆固醇结合能力受损的突变Dishevelled-2未能挽救内源性Dishevelled敲低，说明这种膜招募策略在NC诱导期间经典WNT信号传导中的需求。这些数据共同说明了脂质导向的WNT信号组分向脂筏样结构域组织的关键作用，表明这些机制可能代表NC发育中快速信号调控的方法。通过将棕榈酰化的Wnt配体及其受体集中在脂筏结构域中，这些脂质介导的机制促进β-连环蛋白稳定化和核转位；β-连环蛋白/TCF复合物随后激活众多转录靶标，包括神经板边界基因，从而启动NC基因调控网络。
3.2 FGF信号传导
FGF信号也促进NC的早期形成，其受体（FGFRs）可以激活多种细胞内级联反应，包括丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）/细胞外信号调节激酶（ERK）和PI3K/AKT途径。FGFR激活通常诱导PI3K活性。PI3K然后磷酸化常见的膜信号脂质PIP2以产生PIP3，然后通过其脂质结合结构域将蛋白激酶AKT招募到质膜。斑马鱼和非洲爪蟾胚胎中PI3K或AKT信号传导的缺失导致NC标记物表达降低，说明其对NC形成的要求。类似地，使用显性负性FGFR1的研究表明，早期FGF信号传导在鸟类NC诱导中的必要性；虽然实验揭示了FGF依赖性ERK1/2激活与后期BMP信号传导在此过程中的串扰，但PI3K的可能参与尚未被明确排除。FGFR参与也已被证明导致磷脂酶C的下游激活，随后产生脂质代谢物二酰甘油（diacylglycerol），其激活蛋白激酶C（PKC）以协调细胞增殖和存活。该途径对后期NC衍生颅面发育的重要性通过FGFR2过度激活导致颅骨过早骨化的发现而得到强调。最近，我们确定了分泌性脂质结合蛋白载脂蛋白D作为FGF靶标，是早期颅发育期间MAPK依赖性耳基板（otic placode）特化所必需的，它在正反馈环路中发挥作用以加强ERK1/2激活，说明脂质结合蛋白如何在发育过程中放大形态发生素信号反应。总之，这些磷酸肌醇和其他脂质介导的机制确保稳健的FGF/MAPK和PI3K/AKT激活，驱动神经板边界特化因子的转录并在诱导期间促进NC细胞存活。
3.3 BMP信号传导
在初始FGF信号传导后，中等水平的BMP信号传导对NC诱导也至关重要，该信号水平部分通过质膜相关调控蛋白的梯度表达来调节。膜脂质结合蛋白酪蛋白激酶相互作用蛋白1（CKIP-1）被PI3K活性招募到质膜，然后它将E3泛素连接酶SMURF1招募到质膜。在那里，SMURF1启动SMAD1/5/8的降解，SMAD1/5/8是BMP途径激活的信号转导分子。我们之前表明，破坏CKIP-1或SMURF1的表达或定位会失调BMP信号传导，导致NC细胞丢失。因此，通过利用膜脂质结合来支架BMP受体、其转导分子和抑制性泛素连接酶之间的相互作用，膜组织作为调控层发挥作用，确保诱导NC细胞所需的适当BMP信号反应的稳健性。在其他背景下，CKIP-1对多种磷酸肌醇具有亲和力；由于PI3K重塑磷酸肌醇并在NC中FGF信号传导下游被激活，这种早期FGF活性可能通过启动膜以招募CKIP-1来与BMP途径串扰，从而将BMP反应调整到NC诱导所需的中等水平。未来探索膜脂质含量变化如何影响CKIP-1定位的工作可以进一步阐明脂质代谢如何区室化和组织发育信号传导。
3.4 Sonic hedgehog信号传导和胆固醇
除了WNT、BMP和FGF，最近的证据表明Sonic hedgehog（SHH）信号传导参与羊膜动物的NC形成。SHH信号组分在NC细胞中表达，SHH响应转录因子GLI3的敲低减少了小鼠和鸡体内以及人诱导多能干细胞衍生的NC体外的NC特化。迄今为止，只有两种蛋白质，都属于Hedgehog信号通路，被发现是胆固醇化的，即共价连接胆固醇部分：分泌的Hedgehog配体和smoothened（SMO）G蛋白偶联受体。Hedgehog配体分别在其N-和C-末端被棕榈酰化和胆固醇化。这些脂质修饰是创建可溶性Hedgehog复合物所必需的，并在Hedgehog信号传导的多个步骤中发挥重要作用。脂质化依赖性疏水性与Hedgehog信号传导效率紧密相关，因为体外用增加的N-末端酰基链长度（即增加疏水性）的修饰增加了信号激活。在SHH表达细胞的表面，双重脂质化将Hedgehog锚定在质膜的外层叶，直到它被蛋白质dispatched RND转运蛋白家族成员1（DISP1）从膜中提取；从那里，可溶性携带蛋白SCUBE2与Hedgehog上脂质部分之间的疏水相互作用将复合物保持在一起。此外，Hedgehog配体的脂质化调控它们与细胞外基质蛋白的相互作用，并使发育组织中空间蛋白质梯度的创建成为可能。
在接受Hedgehog信号的细胞的质膜处，脂质也在信号转导过程中发挥重要作用。在没有Hedgehog信号传导的情况下，patched 1（PTCH1），一种跨膜甾醇转运蛋白，持续减少可激活SMO（一种甾醇调控的GPCR）的膜胆固醇可用池。脂质化Hedgehog与PTCH1之间的相互作用刺激其内吞和溶酶体降解，抑制其甾醇转运能力并去抑制SMO。这种胆固醇依赖性SMO激活驱动GLI转录因子（GLI1/2/3）的核转位，其调控对NC特化和迁移至关重要的靶基因表达，包括BMP和WNT途径的组分。有趣的是，Disp1-null小鼠显示颅面畸形，可以通过非胆固醇修饰的Hedgehog挽救。由于DISP1是释放产生Hedgehog细胞中胆固醇修饰的Hedgehog所必需的，这表明胆固醇部分主要功能是将Hedgehog锚定在膜上直到调控释放，而棕榈酰化单独足以在接收细胞中发挥信号活性。因此，胆固醇修饰可能为Hedgehog信号传导增加一层空间调控，而不是严格需要信号转导。还有多篇关于与Hedgehog脂质化突变体相关的颅面异常的报道，强调了这种信号调控水平在NC发育中的本质重要性。
胆固醇生物合成受转录因子甾醇调节元件结合蛋白（Srebp2）的关键调控，Srebp2-/-敲除小鼠在发育中的肢芽中显示Hedgehog转录靶标Bmp4和Gli1表达减少。虽然尚未在NC中显示，但这进一步说明了这种形态发生素的信号效率与胆固醇可用性之间的联系。由于最近的证据表明Hedgehog配体及其Patched家族受体都定位于细胞丝（cytonemes），这些突起膜结构可能既可以释放也可以接收Hedgehog信号。因此，探究NC发育早期阶段甾醇和其他膜脂质生物合成途径的时空调控，可以揭示NC细胞用来调整其发送和响应形态发生信号能力的有趣调控节点。
除了修饰Hedgehog信号传导，胆固醇已分别涉及NC形成的多个步骤。在热带爪蟾早期发育期间，胆固醇转运蛋白载脂蛋白C-I（ApoC1）的表达受WNT信号传导控制，是神经板边界形成所必需的。由于ApoC1在这些早期胚胎阶段被分泌，这表明胆固醇可以用作NC发育所必需的细胞间通讯形式。与脂质修饰在hedgehog途径长程信号传导中的重要性一样，这些发现强调了脂质和脂质修饰在胚胎发育过程中协调组织模式的作用。
鉴于这些脂质介导的调控机制对早期NC形成的广泛影响，它们的适当部署对于NC在经历EMT和迁移时的持续发育至关重要。虽然戏剧性的膜重塑在发育的这些后期阶段最为明显，但这提出了一个有趣的可能性，即脂质组异质性在外胚层中更早开始，为细胞最终命运做好准备。脂质组学技术的进步将使未来能够探索NC特化期间这些脂质和膜动力学。
4 膜脂代谢重塑膜特性以启用分层和迁移
为了迁移到体内远处部位，NC细胞从神经上皮分层并经常经历EMT，这是细胞行为的重大转变，在此过程中细胞逐渐脱落更多上皮特性，转而增强运动性和间充质特征。EMT和分层由另一波形态发生素信号触发，特别是来自WNT和BMP途径的信号。小鼠中的一部分NC细胞不是通过EMT分层，而是使用密度依赖性挤压机制，然后才经历EMT并启动间充质迁移。分层后，NC细胞广泛迁移离开胚胎中线以填充颅面骨骼、软骨和感觉神经节等结构。由于EMT和迁移的发育信号事件必须在空间和时间上精确协调，通过代谢调控改变质膜脂质组成为此类协调提供了机会。具体来说，精确的质膜脂质含量决定其形成信号平台（即脂筏）的倾向、其流动性和可变形程度、其对机械线索的响应性以及其生物活性信号脂质的产生。在这里，我们将讨论最近的工作，证明NC细胞分层和迁移过程中脂质代谢动态重塑的作用。
4.1 鞘脂代谢在EMT期间驱动膜重塑和内吞作用
通过筛选迁移前和迁移性颅NC细胞之间的差异基因表达，我们最近确定了多种脂质代谢酶在EMT和迁移开始期间被动态调控。其中包括中性鞘磷脂酶2（nSMase2，由SMPD3编码），它被棕榈酰化以运输到质膜，在那里它将鞘磷脂水解为神经酰胺。我们发现它在颅NC细胞经历EMT和迁移时优先表达，并且是这些细胞通过激活内吞作用进行EMT所必需的。这激活了促EMT信号级联反应，包括WNT和BMP，同时也促进了上皮细胞粘附分子如Cadherin-6b从质膜的必要内化。该模型表明，EMT期间常驻质膜蛋白的内化可能与上皮富集膜脂质的类似内化同时发生，赋予现在迁移的NC细胞可能更适合迁移的新脂质组成。这一模型很有趣，并与其他背景一致：例如，在Madin-Darby犬肾细胞的EMT期间，总胆固醇水平在EMT期间下降，鞘脂种类显示缩短的链长度和增加的不饱和度。癌细胞也通过增加多不饱和脂肪酸水平或调节胆固醇含量来调节其膜脂质含量，这些效应与癌症侵袭增加相关。
NC细胞中这些脂质代谢的功能变化由NC基因调控网络的活性控制。鸟类NC中SMPD3表达受SOX10直接调控，SOX10是迁移性NC基因调控网络的核心成员，表明鞘脂代谢与迁移性NC身份和能力紧密相连。此外，核受体Nrf1/2是小鼠中产生足够迁移性颅NC细胞所必需的，敲除和染色质免疫沉淀实验表明它直接调控磷脂酶γ2（Plcg2）的表达，该酶水解PIP2以产生脂质第二信使肌醇三磷酸和二酰甘油。有趣的是，Plcg2表达在晚期迁移性颅NC细胞中富集，表明在迁移过程中基本利用脂质代谢来传播细胞信号级联反应。在人类中，磷脂酶B4突变导致耳廓-髁突综合征（Auriculo-condylar syndrome），其中第一和第二鳃弓中NC迁移缺陷导致包括小颌畸形在内的颅面异常。这些例子揭示了NC细胞主动调控其脂质代谢景观；然而，NC EMT期间发生的具体组成变化及其影响，仍然是NC生物学中的一个重要前沿。
除了改变质膜组成，鞘脂代谢还通过产生细胞外囊泡调控NC迁移。迁移性NC细胞释放富含神经酰胺的细胞外囊泡或外泌体（exosomes），这些囊泡在体外有效迁移中至关重要，并与迁移体（migrasomes）具有分子相似性。使用RAB27A抑制剂阻断多泡体胞吐作用阻止了外泌体释放，抑制了迁移速度和方向性，并导致极性形态丧失和采用圆形细胞表型。NC衍生的细胞外囊泡后来也在体内发挥作用，将microRNA miR-203递送至三叉神经基板细胞并介导三叉神经节形成。重要的是，nSMase2功能可能对外泌体生物发生至关重要：nSMase2敲低减少了体外少突胶质细胞的外泌体释放，使用泛nSMase抑制剂GW4869的实验表明对NC迁移有类似但不太显著的影响，如通过RAB27A抑制检测到。然而，其他使用nSMase2敲除小鼠的报告未能检测到外泌体含量的差异，这使nSMase2与其他背景下外泌体生物发生之间的联系受到质疑。虽然这些结果共同说明了nSMase2依赖性鞘脂代谢在NC迁移中的重要作用，但精确机制，特别是nSMase2是否直接调控NC中的外泌体生物发生，需要进一步研究。
4.2 脂筏支架蛋白在迁移过程中动态表达
鞘脂和胆固醇驱动脂筏结构域的形成，多种脂筏相关支架蛋白在NC迁移过程中动态表达。例如，flotillins是通过棕榈酰化和肉豆蔻酰化被招募到这些信号平台的脂筏相关蛋白。Flotillins促进蛋白质-蛋白质相互作用，以在多种背景下促进信号转导，包括T细胞受体信号传导、轴突再生期间的小GTP酶激活以及通过RAB11A阳性内体的受体回收。重要的是，flotillin基因在脊椎动物胚胎发生过程中显示动态表达。斑马鱼flotillin同源物flot1b和flot2a在受精后12小时最初在整个胚胎中表达，但到16小时变得局限于包括NC细胞在内的特定组织；有趣的是，后期NC衍生物包括颅神经节保留flot2a并共表达flot1a。类似地，在非洲爪蟾胚胎中，flotillin-1A最初在外胚层中广泛检测到，但变得富集于神经外胚层、鳃弓间充质，最终在基板和NC细胞衍生物中。功能上，flotillins对斑马鱼表皮包被（epiboly）期间集体细胞迁移中的E-钙粘蛋白介导的细胞-细胞粘附至关重要，并促进果蝇翅盘中脂质修饰形态发生素WNT和Hedgehog的分泌和梯度形成。flotillin基因在基板和NC细胞中的表达表明，这些膜筏蛋白在其发育过程中同样调控信号传导和迁移。
在鸡胚中，另一种脂筏支架蛋白Raftlin-2（RFTN2）被确定为NC细胞迁移的潜在调控因子，基于转录组数据显示该基因在迁移性NC细胞中的表达与迁移前NC细胞相比显著上调。通过原位杂交研究，我们最近证实RFTN2在鸟类胚胎中动态表达，在特化和迁移性NC群体中强烈富集，而其旁系同源物RFTN1在NC中未显示强或空间限制性表达。鉴于Raftlin蛋白已涉及VEGFR信号传导，且VEGFs作为引导NC迁移的重要迁移线索，这提出了脂筏是响应多种趋化线索的NC细胞迁移行为重要支架的可能性。
4.3 膜流动性和机械感觉调控迁移能力
由于脂筏主要由更饱和、刚性脂质与更不饱和、流动性脂质相分离形成，发育转变期间脂质含量的变化对细胞膜产生更广泛的生物物理效应，超出形成脂筏的倾向。增加或减少整体膜流动性可以对细胞有效迁移的能力产生显著影响，这种效应在癌症转移过程中早已被认识到。例如，通过乙醇处理增加质膜流动性增加了黑色素瘤细胞系迁移和侵袭，而膜刚性化药物反而抑制黑色素瘤细胞EMT。随着在NC EMT开始时观察到的脂质代谢重编程，这些发现表明膜脂质含量的主动变化可能是有效EMT和迁移所必需的。尽管在广泛的迁移背景下，膜流动性增加与侵袭行为之间存在明确相关性，但流动性如何决定侵袭能力的强机制理解仍有待揭示。
膜的生物物理特性也微调细胞机械感觉。最近，机械敏感质膜离子通道PIEZO已被证明响应组织硬度增加，该事件激活YAP/TEAD信号传导和NC EMT，指导它们在非洲爪蟾中的迁移。类似地，Piezo1是小鼠NC分层所必需的，YAP/TEAD在鸡中是必需的，表明这是NC传播广泛使用的机制。作为一种机械敏感离子通道，PIEZO对质膜中的局部机械力敏感，在静息状态下存在于弯曲膜区域，当膜被拉伸绷紧、增加局部张力时打开。膜鞘脂、胆固醇和磷酸肌醇也调控PIEZO的活性；例如，PIP2和神经酰胺都促进PIEZO活性，而鞘磷脂作为负调控因子。在小鼠神经母细胞瘤细胞中，Piezo1激活和失活动力学由饱和的十七烷酸调节，它增加膜弯曲刚度并抑制Piezo1激活，而多不饱和酸二十二碳六烯酸增加了Piezo1通道失活的时间。由于这些脂质赋予质膜的生物物理特性差异，这些发现提出了一种模型，其中更刚性、抵抗弯曲的膜抑制PIEZO通道活性，而更流动的膜环境允许其活性。由于PIEZO通道对膜张力和曲率 uniquely 敏感，并且因为局部脂质组成导致包括曲率在内的膜拓扑结构变化，进一步研究迁移中NC内特定脂质的身份、空间分布和几何形状可能揭示与其EMT和迁移相关的有趣机制。
4.4 生物活性脂质调控神经嵴细胞迁移
除了鞘脂和胆固醇介导的结构和组织作用外，由膜脂质产生的其他生物活性信号分子也调控NC迁移行为。例如，前列腺素（prostaglandins），在...
