高浓度的硝酸盐会通过一条不依赖铵的途径抑制Azotobacter chroococcum中的固氮作用

《Microbiological Research》：Elevated nitrate levels inhibit nitrogen fixation in Azotobacter chroococcum via an ammonium-independent pathway

　　摘要：硝酸盐会抑制共生和自由生活的生物固氮（BNF）过程。虽然硝酸盐诱导的磷酸化信号通路已被证实会抑制共生固氮，但自由生活固氮的抑制通常归因于硝酸盐同化过程中产生的铵离子。然而，硝酸盐是否能够在不涉及铵离子反馈调节的情况下单独抑制自由生活固氮，目前尚不清楚。本研究使用了一种失去铵离子调节能力的Azotobacter chroococcum（A4）突变体来探究硝酸盐是否独立于铵离子调节来抑制固氮。尽管缺乏铵离子的抑制作用，硝酸盐仍然显著抑制了固氮反应。当硝酸盐浓度超过2 mM时，它减少了细胞外铵离子的积累；10 mM的硝酸盐使铵离子的产生量降低了61%。综合多组学分析显示，硝酸盐引发了多个分子层面的广泛调控重编程，包括转录组、蛋白质组和磷酸蛋白质组层面的协调和特异性响应。这些响应与典型的铵离子介导的反馈调节不同，后者表现为固氮相关基因或蛋白的显著抑制，但硝酸盐仍导致了铵离子排出的减少，并伴随生物量的增加以及细胞外聚合物物质（EPS）的生成。这些发现表明，硝酸盐并非直接抑制固氮机制，而是通过全局性的调控重编程来抑制固氮输出，这种重编程改变了细胞的新陈代谢和资源分配。这项研究为硝酸盐对自由生活固氮菌的调节提供了新的见解，并对优化氮管理及提高固氮微生物的应用具有重要的意义。

引言：在草原生态系统中，氮循环主要依赖于生物固氮（BNF），而合成氮肥（SNFs）经常被用来提高管理草地的生物量（Bai等人，2009年；Marques等人，2017年）。除了引发各种环境问题（Udvardi等人，2015年；Bijay和Craswell，2021年）外，合成氮肥还会抑制自然固氮并降低其效率（Avila Clasen等人，2023年）。已有研究表明，合成氮肥会抑制草原中的共生和自由生活固氮（Keuter等人，2014年；Tognetti等人，2021年）。因此，在通过肥料提高产量的同时实现自然固氮的有效利用，仍然是草原管理中的一个主要挑战。固氮可以以共生和自由生活的形式发生，并受到两种无机氮形式——铵离子和硝酸盐的强烈抑制（Sorger，1969年；Cejudo和Paneque，1987年；Jiang等人，2020年）。截至2023年，尿素和铵基肥料一直是农业氮肥市场的主要产品（FAO，2025年），尿素主要通过土壤中的快速水解释放氨（Sun等人，2019年）。然而，由于土壤微生物群对铵离子的硝化和有机残留物的矿化作用（Martikainen，2022年；Santiago等人，2025年），硝酸盐往往会成为表层土壤中的主要氮形式（Kabala等人，2017年；Rushimisha等人，2022年）。对于铵离子，其对共生和自由生活固氮菌的抑制机制已经相对明确。如Dixon和Kahn所综述的（Dixon，Kahn，2004年），铵离子通过铵响应的NifL–NifA调控系统抑制自由生活固氮，其中NifL抑制NifA的活性，从而阻断固氮基因（nif）的转录；而对共生固氮菌则通过氧气响应的FixL–FixJ系统起作用。相比之下，硝酸盐对共生固氮菌的抑制机制已被充分研究：硝酸盐可以通过促进植物中尿苷酸的积累和减少根瘤中的蔗糖含量来间接抑制固氮（Collier，Tegeder，2012年；Wang等人，2024年；Wang等人，2025年），或者通过诱导宿主Ca2?传感器蛋白激酶磷酸化NIN类蛋白（NLPs）来直接抑制固氮（Liu等人，2017年；Samano等人，2024年）。磷酸化的NLPs随后定位到细胞核，抑制根瘤相关基因的转录（Lin等人，2018年；Shen和Feng，2023年）。然而，在自由生活固氮菌中，硝酸盐主要通过硝酸盐同化为铵离子（A??NRA）途径产生的铵离子来间接抑制固氮（Sorger，1969年；Pagan等人，1977年；Cejudo和Paneque，1986年；Cejudo和 Paneque，1987年）。最近关于自由生活固氮菌中铵离子产生的研究主要集中在铵离子的抑制作用上（Bueno Batista等人，2021年），而硝酸盐对这一过程的直接影响仍了解较少。

早期研究硝酸盐对自由生活固氮的抑制作用主要使用了A??NRA缺陷突变体（Cejudo和Paneque，1986年；Knutson等人，2018年）。尽管这些突变消除了硝酸盐衍生物的间接抑制作用，但同时也引入了其他变量，例如参与硝酸盐还原的蛋白质的丢失。硝酸盐同化途径通常包括硝酸盐转运蛋白NarK（Fukuda等人，2015年）、硝酸盐还原酶（常称为NasA，例如Klebsiella pneumoniae）或NasB（例如Azotobacter vinelandii）（Lin等人，1993年；Ramos等人，1993年）以及亚硝酸盐还原酶（在文献中分别称为NirBD（大肠杆菌）、NasA或NasAC（A. vinelandii）和NasB（K. pneumoniae）（Besson等人，2022年）。在A. vinelandii中，硝酸盐同化操纵子的激活依赖于磷酸化的NtrC（Ramos等人，1993年），而硝酸盐和亚硝酸盐由NasS感知，NasS会释放NasT，一种RNA结合的反终止因子，从而增强操纵子的转录（Luque-Almagro等人，2011年；Wang等人，2014年）。最近的研究表明，亚硝酸盐还原酶的小亚基NirD也具有调节功能，通过抑制RelA来抑制(p)ppGpp的合成（Leger等人，2021年）。作为第二信使，(p)ppGpp的积累会抑制细菌生长（Steinchen等人，2020年），这可能影响全局代谢重编程并进而影响固氮。据报道，在铵离子诱导的固氮抑制过程中，细胞内(p)ppGpp的水平也会下降（Kleiner，Phillips，1981年）。这些观察结果表明，某些蛋白质（如NirD）可能作为信号分子发挥作用，而不仅仅是铵离子本身。虽然已经证明Azotobacter vinelandii的nasAB突变体（AZBB330）可以减轻硝酸盐对氮酶相关H2产生的抑制（Knutson等人，2018年），但长期硝酸盐暴露对固氮衍生铵离子产生的影响仍不明确。因此，来自A??NRA缺陷突变体的证据尚不足以证明硝酸盐对固氮的抑制是通过硝酸盐衍生物（尤其是铵离子）实现的。然而，铵离子强烈抑制氮酶活性，且硝酸盐代谢不可避免地会产生铵离子。因此，确定硝酸盐是否以及在多大程度上独立于铵离子抑制固氮仍然具有挑战性。

在适当的nifL缺失突变体中，固氮作用在一定程度上免受铵离子的抑制（Bali等人，1992年；Bueno Batista和Dixon，2019年），同时保留了完整的A??NRA途径。这类菌株为区分硝酸盐的特定效应和硝酸盐同化过程中的铵离子介导的调节提供了有效的系统。在本研究中，我们使用了一种nifL缺失的Azotobacter chroococcum菌株A4来探究高浓度硝酸盐是否能够独立于铵离子的抑制来抑制自由生活固氮。综合转录组、蛋白质组和磷酸蛋白质组分析显示，硝酸盐暴露引发了与铵离子不同的广泛分子响应。值得注意的是，硝酸盐对固氮的抑制并未导致关键固氮基因或蛋白的显著减少，而是涉及多个细胞过程的广泛调控变化。这些发现表明，硝酸盐通过全局代谢和调控重编程来抑制自由生活固氮，而不是通过经典的铵离子依赖途径，为理解硝酸盐抑制自由生活固氮的分子机制提供了新的见解，并为草原生态系统中的氮管理和固氮菌应用奠定了理论基础。

菌株和培养条件：本研究中使用的主要菌株A4（GDMCC 63557）是在我们的实验室构建的，其nifL基因被截短，从而使固氮作用不受铵离子的抑制（Tian等人，2026年）。使用含有20克 mannitol、0.2克KH2PO4、0.8克K2HPO4、0.2克MgSO4·7H2O、0.1克CaSO4·2H2O、5毫克Na2MoO4·2H2O和5毫克FeCl3的Burk培养基（1升），在28°C下以200 rpm的速度摇动培养该菌株。

在硝酸盐条件下评估固定的氮：将菌株A4培养在添加了硝酸钠的Burk培养基中。硝酸盐抑制固氮，但促进细菌生长和EPS的产生。图1展示了工程化的排铵菌株A4对不同硝酸盐浓度的生理响应。由于失去了铵离子的抑制作用，A4在无硝酸盐（N0）和非常低硝酸盐（N0.1）条件下持续进行固氮并释放铵离子，即使在第3天时细胞外NH4+积累量达到约10 mM（图1A）。在N1条件下，第4至6天NH4+的积累量显著低于N0条件下的积累量，尽管这种差异逐渐减小。

讨论：理解合成氮如何影响自由生活固氮对于优化依赖固氮的草地生态系统管理至关重要。以往的研究主要将硝酸盐对自由生活固氮的抑制归因于通过硝酸盐同化为铵离子（A??NRA）途径产生的铵离子（Cejudo，Paneque，1986年）。相比之下，我们的研究表明，高浓度硝酸盐（> 2 mM）可以通过独立的途径抑制固氮。使用工程菌株A4进行的实验表明，硝酸盐抑制固氮时并未显著抑制固氮相关基因或蛋白的表达，而是引发了转录组和蛋白质组层面的广泛调控变化。

参考文献：（FAO，2025年；Martinez-Argudo和Contreras，2002年）

作者贡献声明：Shi Xiao-Hui：验证；Li Ling-Xia：撰写——审阅与编辑；Lin Jia-Ni：撰写——审阅与编辑；Li Qu-Sheng：撰写——审阅与编辑、资源获取、数据管理、概念构思；He Bao-Yan：撰写——审阅与编辑；Tian Ping：撰写——审阅与编辑、初稿撰写、可视化、调查、数据分析；Xun Yu-Dian：撰写——审阅与编辑、验证；Wang Jun-Feng：撰写——审阅与编辑、验证。

利益冲突声明：作者声明没有已知的财务利益或个人关系可能影响本文的研究结果。

致谢：本研究得到了中国国家自然科学基金（41977265）和济南大学项目（40120175、40122086、40124103）的支持。

作者信息：Tian Ping | Wang Jun-Feng | Xun Yu-Dian | Shi Xiao-Hui | Lin Jia-Ni | Li Ling-Xia | He Bao-Yan | Li Qu-Sheng

单位：广东大学环境与气候学院，环境污染与健康重点实验室，中国广州，510632