《Microchemical Journal》：Development and validation of a green, solvent-free HPLC-UV method for the determination of uric acid in human urine using a 24 full factorial design of experiments
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摘要开发了一种绿色、无溶剂的 HPLC-UV 方法，用于测定人体尿液中的尿酸 (UA)，使用了 24 全因子实验设计 (DoE)，根据 ICH Q2(R2) 和 FDA 指南进行验证，并应用于六名志愿者的尿液样本。同时优化了四个色谱变量：流动相 pH 值、流速、磷酸盐缓冲液浓
摘要
开发了一种绿色、无溶剂的 HPLC-UV 方法，用于测定人体尿液中的尿酸 (UA)，使用了 24 全因子实验设计 (DoE)，根据 ICH Q2(R2) 和 FDA 指南进行验证，并应用于六名志愿者的尿液样本。同时优化了四个色谱变量：流动相 pH 值、流速、磷酸盐缓冲液浓度和样品稀释因子。中心点实验揭示了 pH 4.0-5.5 处的峰肩现象，机制上归因于尿酸中性和单阴离子形式在其 pK??附近的共洗脱。SPSS GLM 分析确定 pH 值为主导因素 (F = 18,928, p < 0.001)。优化条件 (10 mM 磷酸盐缓冲液，pH 7.25；0.60 mL/min；40× 稀释；290 nm) 产生 tR = 3.63 min，日内精度 0.58% RSD，日间精度 1.38% RSD，以及平均加标回收率 95.0 ± 1.4%。校准在 0.5-50 mg/L 范围内呈线性 (y = 23,278× + 2592; R2 = 0.9999)，检出限 (LOD) = 0.534 mg/L (3.18 μmol/L)，定量限 (LOQ) = 1.619 mg/L (9.63 μmol/L)。AGREE 绿色评分为 0.67，反映了仅使用水相流动相、短分析时间 (~4 min) 和单步样品制备。志愿者尿液中的 UA 浓度范围为 1.09 至 6.19 mmol/L，证明了在全参考范围内临床适用性。
引言
尿酸 (UA; MW = 168.11 g/mol) 是人类嘌呤核苷酸代谢的终末分解代谢物，由黄嘌呤氧化酶介导的黄嘌呤氧化产生。尿液 UA 排泄升高或降低与痛风、高尿酸血症、肾结石和心血管疾病相关 [1], [2], [3], [4], [5]。全球痛风患病率持续上升，近期估计表明自 1990 年以来年龄标准化患病率持续增加，并预测至 2050 年将继续增长 [6], [7]，使得准确的、可获得的尿液 UA 定量方法成为持续的临床需求。
反相 HPLC 配合紫外检测 (HPLC-UV) 已广泛应用于尿液 UA 定量 [8], [9], [10]。然而，许多已发表的方法使用有机溶剂，需要多步样品制备，或涉及冗长的运行时间，这与绿色分析化学 (GAC) 原则相冲突 [11], [12], [13]。通过实验设计 (DoE) 进行系统的方法优化，允许在比一次一个因素方法更少的实验中同时评估多个因素及其相互作用，并具有统计严谨的结果评估 [14], [15], [16]。尽管 DoE 在制药 HPLC 中广泛应用，但结构化的 DoE 方法尚未应用于完全无溶剂的尿液 UA 的 HPLC-UV 方法。
在这里我们报告了该方法的开发、优化和完整验证，使用 24 全因子 DoE，并通过 IBM SPSS Statistics [17] 进行统计分析。特征化并解释了中间 pH 值下机制上显著的峰肩现象。验证符合 ICH Q2(R2) (2023) [18] 和 FDA 生物分析方法验证指南 [19]。绿色性使用 AGREE 指标 [20] 进行量化。经过验证的方法应用于六名健康志愿者的随机尿液样本。
章节片段
化学品和试剂
尿酸参考标准 (纯度 ≥99.0%) 购自 Sigma-Aldrich (Merck KGaA)，德国。磷酸二氢钾 (KH?PO?, ≥ 99.5%) 和磷酸氢二钾 (K?HPO?, ≥ 98.0%) 用于流动相制备。超纯水 (18.2 MΩ·cm) 在内部生产 (Milli-Q?, Merck Millipore，德国)。在任何阶段均未使用有机溶剂。
仪器
色谱分析在由 Thermo SpectraSYSTEM 泵、UV-Vis 检测器组成的 HPLC 系统上进行，以及
波长选择
在九个波长 (254, 280, 285, 288, 289, 290, 291, 294 和 300 nm) 进样 10 mg/L UA 标准品，揭示了在 290 nm 处的最大吸光度，与先前报道的值一致 [9], [21]。该波长在尿液中为 UA 提供高选择性，因为包括肌酐 (UV max ≈ 234 nm) 在内的常见基质成分主要在较短波长处吸收 [9]。本研究未评估针对个别内源性尿液成分的正式选择性；然而，该选择
结论
开发并完全验证了一种用于尿液尿酸的绿色、无溶剂 HPLC-UV 方法。24 全因子 DoE，由 IBM SPSS Statistics GLM 分析，在 32 次运行中提供了高效、统计严谨的优化。中心点实验揭示了机制上有信息的 pH 4.0-5.5 处的峰肩，由 pK??附近的 UA 离子物种共洗脱解释，直接指导了 pH 选择。该方法在 0.5-50 mg/L 范围内呈线性 (R2 = 0.9999)，检出限 (LOD) = 0.534 mg/L，
CRediT 作者贡献声明
Naci Polat: 写作 - 审查与编辑，写作 - 原创草稿，验证，方法论，调查，形式分析，数据整理，概念化。
伦理声明
获得机构伦理委员会批准 (批准号 2026000349-1，日期 2026 年 4 月 15 日)。所有参与者提供了书面知情同意。研究遵循《赫尔辛基宣言》。
利益冲突声明
作者声明没有已知的竞争性财务利益或可能被认为影响本文中报道的工作的个人关系。
Naci Polat
