《Conservation Science and Practice》：Importance of using genetic data to inform conservation captive breeding: A tale of two species of threatened macaws (Ara spp.)
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私人收藏中的圈养繁殖是许多受威胁物种保护的关键但往往缺乏记录的组成部分，这可能无意中对遗传多样性和物种完整性构成风险。研究人员采用基因分型测序（GBS）对两个受威胁鹦鹉物种的最大私人收藏之一——大绿金刚鹦鹉（Ara ambiguus）和军用金刚鹦鹉（Ara
私人收藏中的圈养繁殖是许多受威胁物种保护的关键但往往缺乏记录的组成部分，这可能无意中对遗传多样性和物种完整性构成风险。研究人员采用基因分型测序（GBS）对两个受威胁鹦鹉物种的最大私人收藏之一——大绿金刚鹦鹉（Ara ambiguus）和军用金刚鹦鹉（Ara militaris）——进行了遗传审计。在45个个体中，分析揭示了关键的、此前未记录的历史复杂性。研究人员鉴定了7只种间杂交个体和1只形态学误鉴定的纯种个体。研究人员还检测到普遍存在的高度亲缘关系，军用金刚鹦鹉的平均配对亲缘关系值（r = 0.33）和大绿金刚鹦鹉（r = 0.27）接近半同胞的理论期望值，这主要是由于发现了高度互联的家庭网络。此外，研究人员揭示了军用金刚鹦鹉内部的隐性亚结构，将其谱系追溯到墨西哥和南美洲（玻利维亚）的不同地理起源。综合而言，这些发现突显了在无法获取遗传数据的情况下进行历史性繁殖的意外后果，如果这些问题得不到解决，可能会损害收藏的保护价值。研究结果表明，基因组筛选是将历史上缺乏记录的收藏从未表征的遗传资源库转变为有价值的保护资产的重要工具。研究人员为保护从业者提供了一个利用基因组数据纠正谱系、指导配对决策以最小化近亲繁殖以及防止杂交的框架。研究人员主张，这种基因组监督应成为所有迁地保护项目的标准政策和实践，以确保对全球物种恢复工作做出有意义的贡献。
## 论文解读文章
### 一、研究背景与问题
鹦鹉（Psittaciformes）是高度多样化但面临较高灭绝风险的鸟类类群。全球约400种鹦鹉中近三分之一面临灭绝威胁，56%的物种在野外呈现种群数量下降趋势。尽管鹦鹉仅占所有鸟类物种的约4%，却在被认定为具有进化独特性且全球濒危（EDGE）的物种中约占8%。在鹦鹉保护危机日益严峻的背景下，保护和繁育领域的专家倡导对58种鹦鹉进行保护性圈养繁殖，作为应对灭绝或野外种群严重衰退的保险策略，并建议纳入非机构饲养者（私人鸟类养殖者）的参与，因为动物园和野生动物园的资源不足以应对大量需要保护行动的鹦鹉物种。
过去几十年中，受威胁鹦鹉物种迁地保险种群的重要性日益凸显。目前有49种鹦鹉需要迁地保护管理行动。斯派克斯金刚鹦鹉（Cyanopsitta spixii）于2019年被正式列为野外灭绝，并因严重的历史种群瓶颈而饱受低遗传变异性和高度亲缘关系之苦。尽管如此，该物种仍被几位私人鸟类养殖者从灭绝边缘挽救，其圈养个体现已成为巴西原分布区重新建立受保护种群的国际努力的一部分。类似地，橙腹鹦鹉（Neophema chrysogaster）和波多黎各亚马逊鹦鹉（Amazona vittata）的圈养种群均被用于补充各自野外种群以避免灭绝。
尽管许多动物园和相关公共机构认真承担了帮助保护世界生物多样性的责任（即“方舟”概念），但问题的规模超出了它们的应对能力。有限的空间、专业技能需求以及展示魅力型大型动物的经济压力限制了动物园能够饲养的物种数量和类型。因此，如果私人收藏要填补这一空白并为物种保护做出有意义的贡献，严格的、基于科学的管理方法至关重要。具体而言，纳入遗传数据可以指导管理工作，以成功维持基因组多样性并最小化近亲繁殖。然而，历史上美国鹦鹉饲养者对遗传方法的采用一直有限，主要由于测试费用高昂、缺乏可用的商业工具，以及原始基因组数据需要专家解读等限制。
本研究聚焦的两个目标物种——大绿金刚鹦鹉（Ara ambiguus）和军用金刚鹦鹉（Ara militaris）——完美地体现了这一保护挑战。这两个物种在野外均面临栖息地破坏和国内外非法宠物贸易带来的严重偷猎威胁。大绿金刚鹦鹉目前被世界自然保护联盟（IUCN）列为极度濒危，全球野生种群估计不足1000只成熟个体。军用金刚鹦鹉被列为易危，估计种群数量为2000–7000只成熟个体且呈下降趋势。在美国，这两种受威胁金刚鹦鹉的圈养种群主要分布在经认证的动物学机构和私人鸟类养殖领域。动物园和水族馆协会（AZA）内的圈养管理通过正式的物种生存计划（SSPs）进行协调，该计划依赖物种360数据库（ZIMS）中的历史谱系数据来计算平均亲缘关系并做出基于遗传信息的繁殖建议。
目前，ZIMS全球记录显示，202只大绿金刚鹦鹉和791只军用金刚鹦鹉分别饲养在63个和190个经认证的机构中。然而，SSP种群通常受到有限饲养空间的限制。因此，私人领域存在一个规模大得多但缺乏记录的种群。虽然缺乏集中的人口登记系统，但2012年的一项在线调查提供了基本的全国性数量统计，估计美国私人饲养了至少138只大绿金刚鹦鹉和435只军用金刚鹦鹉，其创始种群基础 largely 未知。在SSP框架之外运作的私人收藏通常缺乏多代谱系数据，而这些数据是计算平均亲缘关系和维持人口稳定性所必需的。因此，分子工具对于评估其遗传健康状况并确定其对更广泛保护工作的潜在价值至关重要。这些工具的必要性在美国尤为紧迫，因为2015年多种金刚鹦鹉物种被列入《濒危物种法》（ESA）后，州际商业贸易被禁止，实际上抑制了繁殖积极性，使私人种群陷入困境并阻止了全国性的遗传交流。
大绿金刚鹦鹉和军用金刚鹦鹉为评估私人鸟类养殖相关的遗传风险和保护的机遇提供了理想的模型系统。它们密切的系统发育关系、表型相似性以及历史上被视为同种的处理方式，使其特别容易发生无意的杂交，这是迁地保护完整性的主要威胁。尽管私人领域饲养了大量这两种金刚鹦鹉，但其真实的遗传生存力、谱系历史和分类完整性在很大程度上仍然未知。因此，即使是出于善意的繁殖努力也面临着与潜在隐性杂交、普遍近亲繁殖以及不同地理谱系人为混合相关的不可避免的挑战，所有这些都必须解决才能最大化其保护价值。
本研究利用双酶切限制性位点相关DNA测序（ddRAD-seq）产生的核DNA和靶向DNA测序产生的线粒体DNA数据，评估了美国最大的这两种金刚鹦鹉私人繁殖收藏之一，该收藏是在它们被列入ESA之前建立的。该收藏提供了一个理想的概念验证，因为其规模涵盖了私人鸟类养殖的许多遗传复杂性特征，包括未记录的亲缘关系、隐性种群结构和不确定的创始者起源。具体而言，研究人员评估基因组筛选是否能够：（1）检测隐藏的种间基因渗入；（2）量化隐性亲缘关系以重建缺失的谱系；（3）利用线粒体ND2变异解析地理亚结构。
### 二、主要技术方法
研究人员主要采用了以下关键技术方法：（一）双酶切限制性位点相关DNA测序（ddRAD-seq）技术，使用SphI和MluCI酶切组合对46个样本（包括30只大绿金刚鹦鹉、15只军用金刚鹦鹉和1只灰鹦鹉外群）进行基因组规模SNP鉴定，最终获得4181个双等位基因SNP位点用于分析；（二）线粒体NADH脱氢酶亚基2（ND2）基因（1041 bp）的靶向Sanger测序，用于追溯母系起源并与已知地理来源的野生参考序列进行系统发育比较；（三）多种群体遗传结构分析算法，包括主成分分析（PCA）、判别主成分分析（DAPC）和稀疏非负矩阵分解（SNMF）；（四）系统发育重建方法，包括基于Nei氏遗传距离的邻接树、基于Prevosti氏遗传距离的最小生成网络以及基于贝叶斯推断的ND2基因树；（五）亲缘关系重建与谱系推断，使用Sequoia软件包基于全局似然框架进行高置信度谱系重建，并使用TrioML估计器进行成对亲缘关系定量分析。样本采集自德克萨斯州山乡村禽鸟园（Hill Country Aviaries）的布丰金刚鹦鹉保护中心，血液样本由认证禽类兽医监督采集。
### 三、研究结果
**3.1 种群遗传结构**
在排除外群灰鹦鹉后，集群分析确定了三个明确的遗传分组。一只被记录为大绿金刚鹦鹉的个体（#41）在分析中明确与军用金刚鹦鹉样本聚类，被重新分类为纯种军用金刚鹦鹉。基于同一数据集，SNMF混群分析表明K=2–4具有最低的交叉熵值，其中K=3获得最高支持。七只原被分类为大绿金刚鹦鹉的个体（#2、3、4、6、7、8、9）被鉴定为混血个体，很可能是大绿金刚鹦鹉与军用金刚鹦鹉的杂交后代，这一结果也得到了线粒体ND2分析的确认。排除这些杂交个体后，三种方法在所有分析中一致显示三个不同遗传群组的最优聚类。大绿金刚鹦鹉保持为一个单一、内聚的遗传群组。相比之下，军用金刚鹦鹉明显划分为两个不同群组，其中一个群组对应推测为玻利维亚亚种的样本，这一划分与ND2序列数据确定的地理分化一致。对军用金刚鹦鹉组的单独遗传分析显示其具有清晰的遗传亚分化为两个不同群组（最优K=2），将个体#12、13、14、15和21与其他军用金刚鹦鹉样本分开。这种遗传分化在核DNA标记和线粒体DNA分析中均得到支持。相比之下，大绿金刚鹦鹉个体 largely 表现出均一的遗传背景（SNMF分析中最低交叉熵为K=1），但个体#33、38和42在祖先图谱中有微弱聚类迹象，然而由于ND2数据对该物种缺乏足够的分辨率（ND2支系后验概率估计较低），无法确定这些圈养个体潜在祖先的野外位置。
**3.2 系统发育关系**
基于SNP的系统发育分析与种群遗传结构分析结果总体一致。使用Nei氏遗传距离构建的邻接树和使用Prevosti氏遗传距离构建的最小生成网络均清晰区分了这两个物种，被误鉴定的样本#41与其他军用金刚鹦鹉样本聚类，并鉴定出同一组先前识别的杂交个体。研究中所有个体的最大Prevosti氏遗传距离相对较小（10%）。值得注意的是，在网络中，军用金刚鹦鹉组内的全同胞群组紧密聚类，反映了该群体较高的背景亲缘关系（平均r = 0.33）以及可能较低的亲本杂合度。相比之下，一些大绿金刚鹦鹉全同胞组合显示出较大的离散度，这是杂合度更高的亲本所预期的模式。基于贝叶斯ND2树，研究人员能够将部分圈养鸟类归类到广泛的地理区域；然而，若干样本聚类到缺乏已知来源参考序列的支系中。在大绿金刚猩猩组合内观察到两个亚组，但由于已发表的哥斯达黎加和厄瓜多尔参考序列在该位点未显示遗传分化，无法将圈养大绿金刚鹦鹉个体分配到特定地理起源。在军用金刚鹦鹉组合内观察到五个亚组，大致对应中美洲和南美洲谱系。尽管存在一些明显的地理分化，但由于缺乏来自南美洲中间分布区（如秘鲁、哥伦比亚、厄瓜多尔和委内瑞拉）的参考序列，精确的空间分配受到了限制。
**3.3 遗传多样性**
在总共4143个双等位基因SNP中，0.7%的变异在两个内群物种的所有个体中呈固定状态，40.8%为两个物种共享，35.9%为物种私有或不同物种间不共享。大绿金刚鹦鹉群组包含最高比例的多态性SNP（91%），其次是军用金刚鹦鹉（88%）和杂交个体（82%）。排除混血样本后，大绿金刚鹦鹉和军用金刚鹦鹉的观测杂合度估计值相当，而潜在杂交样本显示出更高的值。三个群组中所有位点平均的固定指数均为负值。大绿金刚鹦鹉与军用金刚鹦鹉之间的成对FST值显示中等程度的遗传分化（FST = 0.055, p = .001），进一步支持了独立物种的划分。正如预期，潜在杂交群组与大绿金刚鹦鹉（FST = 0.035, p = .001）及军用金刚鹦鹉（FST = 0.033, p = .002）之间的成对FST值较低。各群组内个体近交系数（Find）的中位数在杂交个体中最低，其次为大绿金刚鹦鹉和军用金刚鹦鹉群组。分析发现了一些偏离预期变异的离群值（军用金刚鹦鹉#14，以及大绿金刚鹦鹉#38、42、33、39和27）。其中一只大绿金刚鹦鹉个体（#38）具有正的F值（Find = 0.037），代表了近交个体。
**3.4 亲缘关系**
使用Sequoia进行的主要谱系重建的成对比较产生了三个群组中的15对全同胞组合。这些包括不同的、高度连接的家庭网络，如一组三只全同胞军用金刚鹦鹉（#14、15、21），另一组四只全同胞军用金刚鹦鹉（#18、24、44、45），以及一组四只全同胞大绿金刚鹦鹉（#20、28、29、31）。通过“GetMaybeRel”功能进一步探索未在该高置信度谱系中解决的遗传联系，识别了大量额外的成对个体，其似然比提示存在密切亲缘关系，许多处于与全同胞相当的水平。对母系遗传的ND2基因的分析揭示了其中一些SNP定义的同胞网络中的细微线粒体变异：某些SNP定义的全同胞组共享完全相同的ND2序列，而另一些则显示线粒体差异，这一不一致性表明这些特定个体是父系半同胞——可能是同一只多产雄性与多只密切相关的雌性后代——它们的整体核遗传相似性被人为地抬高到统计上模拟全同胞的程度。利用分子亲缘关系进行的估计支持了先前对个体的分组。平均TrioML成对亲缘关系值在杂交个体内部最高（0.35），其次为军用金刚鹦鹉（0.33）和大绿金刚鹦鹉（0.27），而军用金刚鹦鹉与杂交个体间（0.24）、大绿金刚鹦鹉与杂交个体间（0.19）以及大绿金刚鹦鹉与军用金刚鹦鹉间（0.12）的对比值最低。
### 四、讨论与结论
本研究通过对一个大型（n = 45）私人收藏的大绿金刚鹦鹉和军用金刚鹦鹉进行基因组筛选，展示了现代基因组技术如何解析复杂的圈养历史，揭示关键的、往往隐藏的保护挑战。研究发现杂交、隐性种群结构和普遍亲缘关系的证据，如果不加以管理，所有这些都会损害收藏的保护潜力。这些发现提供了一个具有广泛适用性的明确案例研究，突显了将基因组方案整合到迁地种群管理中的迫切需求，特别是那些在协调国际项目之外的种群。
关于杂交问题，由于大绿金刚鹦鹉和军用金刚鹦鹉在外观上相似，迁地条件下的表型鉴定仍然高度主观。形态学重新评估表明，微妙的线索（如中等体型、绿色翼覆羽的光泽和色调变化以及中央尾羽颜色的差异）可能暗示混血，但这些外部特征很微妙，强调了基因组验证的必要性以防止圈养中的无意杂交。有趣的是，所有七只鉴定出的杂交个体都具有军用金刚鹦鹉的线粒体ND2单倍型，表明每次杂交事件中的母本都是军用金刚鹦鹉。这并非反映先天的生物学交配偏好，而是该收藏历史的产物——许多这七只杂交个体可能是一只非常多产的混交对（一只大绿金刚鹦鹉雄性和一只军用金刚鹦鹉雌性）的后代。
关于种群亚结构，军用金刚猩猩群组内存在明显的遗传亚结构，通过线粒体DNA与参考序列的比较，研究将这些谱系追溯到墨西哥和南美洲（可能为玻利维亚）的不同地理起源。鉴于该物种在中美洲和南美洲高度破碎的自然分布，加入来自中间地理范围的参考样本可能会揭示更多地理上不同的支系。然而，这些群组之间具有混合血统的个体的存在，凸显了亚种在无意中被混合了数代的圈养种群管理的长期复杂性。从保护角度来看，这些不同的谱系可能代表不同的管理单元，忽视这种结构可能导致远交衰退或局部适应的丧失。
关于普遍亲缘关系问题，军用金刚鹦鹉（平均值0.33）和大绿金刚鹦鹉（平均值0.27）群组内的平均成对亲缘关系远远超过哥斯达黎加野生大绿金刚鹦鹉种群（0.14；n = 13）和高度管理的欧洲濒危物种计划（EEP）种群（0.07；n = 22）的水平。这些升高的值接近或超过半同胞的理论期望值（r = 0.25），表明创始者基础严重有限且存在近亲繁殖的历史。即使私人饲养者从多个不同的州获取鸟类，由于进口到该国的创始者总数较少，获得相关个体的概率仍然很高。此外，历史上的捕捉做法通常涉及从单个巢穴获取整窝同胞或多年来反复掠夺相同巢穴，加之圈养中高度偏斜的繁殖成功率（少数多产个体对主导生产），迅速缩小了可用基因库。研究还发现，一些个体的高近交系数（如MM #14）是这段历史的直接后果，对适应性和长期生存力构成重大威胁。
基于研究结果，研究人员提出了三项关键的管理行动。第一，建立基因组基线并进行全球协调：遗传数据应构成新谱系簿的基础，纠正所有物种和亚种水平的误鉴定，记录每个个体的亲缘关系和近交系数。由于ESA的严格规定使美国国内大规模的物理谱系簿协调极为困难，这一基因组谱系书应直接与国际谱系簿管理者共享，使有价值的美国创始者谱系能够在全球集合种群中被虚拟整合和共同管理。第二，适当管理杂交个体和亚种：七只杂交个体在保护繁殖中没有直接作用，必须单独管理以防止进一步基因流动。同样，军用金刚鹦鹉中不同的墨西哥和玻利维亚谱系应作为独立单元管理以保持其遗传完整性。第三，为剩余种群实施基于遗传信息的繁殖计划：亲缘关系值提供了形成最优先繁殖配对的直接路线图，以最小化亲缘关系和减少未来近亲繁殖。
研究人员指出，尽管将私人收藏纳入正式保护网络的潜在利益巨大，但这种整合可能带来严重的后勤和生物学挑战。私人领域对保护的贡献常常被低估，然而私人繁殖已经产生了关于孵化要求、人工育雏技术和兽医干预的数十年的重要数据。此外，私人领域中这些外来鸟类的存在可能直接推动公众对其野生对应物种保护的兴趣和情感投入。在物种分布国（如哥斯达黎加和墨西哥），保护规划通常依赖于将前私人或没收的鸟类整合到严格政府监督下的高度管理的NGO主导繁殖中心。
然而，尝试将较不正式的美国私人部门整合到保护项目中引入了必须仔细缓解的独特风险。首先，由于缺乏个体背景信息（如确切年龄、野生捕捉状态、历史谱系），鸟类在利用之前需要进行广泛的基因组和兽医审计。其次，如果私人设施缺乏严格的标准化兽医监督，私人收藏和经认证保护中心之间转移鸟类会带来疾病传播的高风险。最后，应用标准遗传管理策略——如转移个体以优化平均亲缘关系——在大型鹦鹉中在生物学上很复杂。因为许多鹦鹉是社会性单配制鸟类，形成长期配对关系，强行破坏已建立的配对以满足遗传目标可能诱发严重的心理压力并导致长期繁殖失败。
本研究突显了美国的一个重大政策空白，即缺乏类似于EEP的该物种协调保护计划。维持遗传多样性和最大化有效种群规模是任何迁地保护计划的首要目标。研究人员强烈主张采用基因组筛选作为所有圈养繁殖项目的标准且不可协商的实践，特别是对于机构网络之外的具有复杂历史受威胁物种。通过为循证繁殖提供明确的基础，这些工具对于确保圈养种群仍然是未来保护行动的可行资源库至关重要。
