环境DNA（eDNA）检测同域分布海马 Hippocampus hippocampus 与 Hippocampus guttulatus 在其向北分布区扩张过程中的两种检测方法

《Environmental DNA》：Two eDNA Assays to Detect the Sympatric Seahorses Hippocampus hippocampus and Hippocampus guttulatus During Their Northward Range Shifts

　　

气候变暖改变物种分布，导致向极地分布区扩张现象增多，近期在斯堪的纳维亚观察到的短吻海马（Hippocampus hippocampus）与长吻海马（Hippocampus guttulatus）可能亦属此列。这两种具魅力且具标志性的鱼类保护关注度高，但在其大部分分布区内研究不足。两物种体型小且隐秘，使传统调查与多物种宏条形码（metabarcoding）等新法均难以准确估算其真实分布。研究人员开发两种物种特异性环境DNA（eDNA）检测方法以评估这些海马的实时存在。研究人员在电脑中设计名为 Hiphip 与 Hipgut 的两个检测体系用于数字PCR（digital PCR，dPCR），随后在体外验证其对其他物种的特异性及对低浓度目标DNA的敏感性。继而利用现场水样进行原位测试，先在葡萄牙Ria Formosa自然公园或西班牙圣塞瓦斯蒂安阳性对照中检出，最终在瑞典一活体相机观察到海马的位点同时检出两物种。两检测体系为监测与保护这两种具魅力但隐秘的物种提供了新型工具。

研究背景与立项依据

气候变暖及其他人为驱动因子正改变国际尺度上的物种分布，向极地分布区扩张（poleward range-shifts）的模型预测不断被野外观察证实。同域分布的短吻海马（Hippocampus hippocampus）与长吻海马（Hippocampus guttulatus）为东北大西洋常见海马，体型小、伪装强、定居性高、形态变异大，且局部种群年际波动显著，被世界自然保护联盟（IUCN）列为“数据缺乏（Data Deficient）”。二者受栖息地破坏、拖网兼捕及气候变化威胁，却因隐秘底栖（cryptobenthic）特性使传统采集与目视调查成本高、侵入性强。环境DNA（environmental DNA，eDNA）分析具备敏感、特异、非侵入、大范围快速处理优势，但海龙科（Syngnathidae）在eDNA研究中代表不足，且目前无公开的H. hippocampus与H. guttulatus物种特异性检测体系。伴随两物种因气候驱动向斯堪的纳维亚半岛扩张（2021年丹麦活体记录、2023—2024年瑞典西海岸记录），亟需低成本、高特异的实时存在检测工具。该研究发表于《Environmental DNA》，旨在填补上述空白。

主要关键技术方法

研究人员采用三个递进验证阶段。在电脑设计（in silico）阶段，构建含两目标种、瑞典本地六种海龙科及近缘线纹海马（Hippocampus erectus）的CO1序列数据库，经系统发育树确认CO1标记可区分目标与近缘种，用Primer 3生成引物/探针候选并以BLASTn与Primer Stats筛选，获得靶向CO1的Hiphip（H. hippocampus）与Hipgut（H. guttulatus）水解探针体系。在体外（in vitro）阶段，使用两目标种组织提取DNA、瑞典西海岸37种同域鱼类模拟群落（mock community）及六種本地海龙科组织提取液，在QIAcuity平台行dPCR，评估特异性、灵敏度（系列稀释定限，LOD）、非靶竞争（1:10与1:100混合）及海水/人工海水/水族馆水抑制效应。在原位（in situ）阶段，于葡萄牙Ria Formosa、西班牙圣塞瓦斯蒂安已知分布点及瑞典西海岸七处2024—2025年目击点采集1—2 L水样，经Sterivex 0.22 μm过滤、PowerWater Sterivex试剂盒提取，行dPCR判定阴阳，并对高拷贝阳性扩增子行Sanger测序BLAST回验。样本队列涵盖伊比利亚阳性对照群与瑞典扩张前沿群。

研究结果

3.1 在电脑设计eDNA检测体系

通过对三尾瑞典及圈养H. hippocampus个体de novo测序补充CO1库，系统发育树显示CO1在两种海马间各自聚支且与本地海龙科分离，证实标记适用。最终锁定Hiphip（扩增109 bp，引物AATTGGGGCGCCCGATATAG / CTGCTCCAGCTTCTACTCCTG，探针FAM标PCCCCCTCTTTCCTCCTCCTCCTCGC-BHQ2）与Hipgut（扩增99 bp，引物TCTTCTGCTTGCTTCATCAGGA / TACAGAGGCCCCAGCATGA，探针HEX标CTGGAGCGGGTACAGGTTGAACGGT-BHQ1），退火温度62°C。

3.2 体外特异性

以约0.1 ng/μL组织提取液行dPCR，Hiphip对H. hippocampus给出约300 copies/μL，对H. guttulatus仅0.12 copies/μL，其余近缘及模拟群落<0.08 copies/μL；Hipgut对H. guttulatus约1230 copies/μL，对H. hippocampus及余者<0.03 copies/μL。两体系均显示严格目标特异性。

3.3 体外灵敏度

Hiphip系列稀释至0.0001 ng/μL仍三联检阳，理论LOD<0.29 copies/μL；Hipgut至0.00002 ng/μL检阳、0.000002 ng/μL未稳阳，LOD<0.58 copies/μL。非靶竞争测试中Hiphip在1:10与1:100混样均达预期10%与1%回收；Hipgut在1:10混样正常，但1:100混模拟群落或H. hippocampus时抑制明显（回收<1%，抑制67%—97%）。抑制实验显示Hiphip在50%海水稀释样中未现抑制，浓度反高于水族馆阳性控。

3.4 现场样本结果

葡萄牙四样Hipgut全阳（其中一样Hiphip亦阳），西班牙圣塞瓦斯蒂安样Hiphip阳（目击H. hippocampus）。瑞典七点仅Bl?bergsholmen（BLA）阳：BLA1经Hiphip检H. hippocampus（最高0.320 copies/μL），BLA3经Hipgut检H. guttulatus（最高0.210 copies/μL），该点前一日活体相机见H. guttulatus。其余瑞典点阴，与目击时效及生境一致。

3.5 原位阳性扩增子验证

取五现场样一水族馆样行Sanger测序，成功五条长34—127 bp，BLAST身份98%—100%归目标种，无区域同域种错配，证实原位特异。

讨论与结论翻译

研究人员在讨论中指出，Hiphip与Hipgut经in silico、in vitro及in situ三级验证，达Thalinger等定义的高标准（Level 4）。Hiphip灵敏度更高且抗非靶竞争强；Hipgut特异性更高且田间证据更丰。两体系LOD接近田间实测峰值（约0.3 copies/μL），故建议未来监测用4—10 L过滤量、每点3—5生物重复、6—10技术重复以提升检出。CO1在H. guttulatus可用序列偏少，高分歧种群或漏检，跨地中海系统等需重评特异性。研究结论部分载明：该研究呈现了靶向H. hippocampus与H. guttulatus CO1基因的Hiphip与Hipgut检测体系，经电脑、体外及原位验证并可自现场eDNA检出测序；即便2025年瑞典仅三尾目击，最新一尾于观察次日被新体系检出并测序。鉴于隐秘底栖小鱼监测之难，此两体系可成两标志种监测与保护之贵重工具。