一种普遍的RT–qPCR伪影高估了RNA靶向CRISPR系统的RNA敲低效果

《Nature Biotechnology》：A pervasive RT–qPCR artifact inflates RNA knockdown by RNA-targeting CRISPR

　　

摘要翻译
RNA靶向CRISPR系统的敲低效率通常通过逆转录定量聚合酶链反应（RT–qPCR）进行测量。本研究发现，在RNA提取过程中，引导RNA（gRNA）会共纯化，并抑制覆盖或位于gRNA结合位点上游的扩增子的RT–qPCR扩增，从而导致所有 tested 的CRISPR系统的敲低效率被高估。研究人员建议使用具有强链置换活性的持续性逆转录酶，并结合正交方法，以确保使用RT–qPCR时定量结果的准确性。

论文解读文章

**一、研究背景与问题**
RNA敲低技术通过靶向RNA转录本而非基因组DNA，广泛用于基因功能研究。常用的敲低工具包括小干扰RNA、短发夹RNA、反义寡核苷酸以及RNA靶向CRISPR系统，其中CRISPR系统尤其适用于靶向核内定位转录本。单效应器系统如PspCas13b和RfxCas13d（CasRx）虽能高效敲低靶标RNA，但可能引发旁切活性。相比之下，多亚基Csm系统可在无可检测旁切活性的条件下实现高效敲低。然而，在验证已报道的Csm介导的敲低效果时，研究人员发现采用RT–qPCR检测得到的敲低效率存在系统性偏差，即使在RNase失活的突变体中也能观察到表观敲低，提示该测量方法本身存在缺陷。这种伪影可能解释了此前多篇文献中关于催化失活突变体仍表现出敲低活性的矛盾结论，也可能影响siRNA、shRNA和ASO等其它RNA敲低工具的定量准确性。因此，系统解析该伪影的机制并建立纠正策略，对于RNA功能研究和临床RNA疗法的疗效评估具有重要意义。

**二、研究内容与结论**
研究人员围绕Csm、PspCas13b和CasRx三种RNA靶向CRISPR系统，系统评估了RT–qPCR在不同扩增子设计下的定量准确性。研究发现，当RT–qPCR扩增子跨越gRNA结合位点或位于其上游近端时，gRNA会在逆转录阶段抑制cDNA合成，导致敲低效率被严重高估。通过合成gRNA加回实验和ddASO竞争实验，研究证实该伪影源于共纯化的gRNA对逆转录酶的抑制。进一步分析表明，抑制程度与扩增子距gRNA结合位点的距离有关，上游近端扩增子受影响显著，而下游扩增子不受影响。为解决这一问题，研究团队评估了具有强链置换活性的持续性逆转录酶uMRT，发现该酶能够在跨gRNA结合位点的扩增子设计中实现准确定量，所得结果与下游扩增子的测量一致。最终，研究建议采用uMRT配合跨位点扩增子，或使用传统逆转录酶配合下游扩增子，并辅以正交实验验证。该研究发表在《Nature Biotechnology》。

**三、主要技术方法**
研究主要采用以下关键技术手段：（1）基于Addgene来源的Csm全功能质粒（含GFP标记）和gRNA表达质粒进行共转染实验，细胞系为HEK 293T（ATCC CRL-3216）；（2）使用RNeasy Mini Kit（部分实验用TRIzol）提取RNA，并辅以Monarch RNA纯化柱去除残留污染物；（3）采用随机六聚体引物进行逆转录，对比传统LunaScript RT与uMRT两种逆转录酶的定量差异；（4）设计跨越、上游近端和下游三种位置的qPCR扩增子，以验证伪影的位置依赖性；（5）利用合成gRNA加回实验、ddASO竞争实验和蛋白酶K处理等手段剖析伪影的分子机制。

**四、研究结果**
（一）跨越gRNA结合位点的扩增子高估敲低效率
研究人员在验证XIST和BRCA1基因敲低时发现，WT Csm与RD Csm（Csm3-D33A）均表现出表观敲低。但流式细胞术检测mCherry蛋白水平显示仅WT Csm具有真实敲低活性，说明RNA水平的表观敲低来自RT–qPCR的系统性误差。对BRCA1和XIST设计不同位置扩增子后发现，下游扩增子结果与蛋白水平一致，而跨越和上游近端扩增子均高估敲低效率。

（二）多种RNA靶向CRISPR系统均受伪影影响
在PspCas13b和CasRx系统中重复上述实验，结果与Csm一致：跨越扩增子对WT和RD突变体均报告显著敲低，下游扩增子仅在WT中检测到敲低。该伪影具有普适性，波及所有已测RNA靶向CRISPR系统。

（三）gRNA共纯化并抑制RT是伪影的分子基础
蛋白酶K处理不能消除表观敲低，排除残留蛋白的参与。将合成gRNA直接加入逆转录反应可剂量依赖地抑制跨越和上游扩增子，表明gRNA本身足以导致伪影。ddASO竞争结合gRNA后，受影响的扩增子恢复真实值，进一步确认gRNA与靶RNA结合后阻碍逆转录酶通过。伪影幅度随扩增子与gRNA距离增大而衰减，约500 nt后可忽略。

（四）uMRT逆转录酶消除伪影实现准确定量
使用具有链置换活性的uMRT进行逆转录时，RD突变体在所有扩增子位置均无表观敲低，WT酶的敲低效率在各扩增子间高度一致，且与传统RT下游扩增子的结果相符。这表明uMRT能够置换结合在RNA模板上的gRNA，从而允许逆转录酶完整通过靶标区域。

（五）伪影对RNA定量方法学的广泛影响

酚氯仿提取法可能因富集小RNA而加剧gRNA共纯化，Oligo(dT)引物则可能导致所有上游扩增子受抑，RNA测序在无预先片段化时也可能受影响。

**五、讨论与结论**
该研究发现了一种普遍存在的RT–qPCR定量伪影并明确了其分子机制：共纯化的gRNA结合至靶标RNA后阻遏逆转录酶延伸，导致跨越或上游近端扩增子的敲低效率高估。该伪影可解释此前报道的催化失活Cas酶仍显示敲低的矛盾结果，并可能波及siRNA、shRNA、ASO等RNA干扰工具的定量评估。传统的下游扩增子方案可规避伪影但可能因忽略切割片段而低估敲低，因此推荐使用uMRT等持续性链置换逆转录酶配合跨越扩增子进行定量，同时强调RT–qPCR应辅以蛋白水平或流式等正交方法验证。研究结论为RNA基因敲低领域的定量标准化提供了重要的方法学参考，对RNA靶向治疗药的疗效评估与基础研究数据解读具有直接指导意义。